ניטור למידה מוטורית עדינה ואסוציאטיבית בעכברים באמצעות סולם ארסמוס
Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול המאפשר הערכה לא פולשנית ואוטומטית של ביצועי המוטוריקה העדינה, כמו גם למידה מוטורית אדפטיבית ואסוציאטיבית, על אתגרים, באמצעות מכשיר הנקרא סולם ארסמוס. קושי המשימה יכול להיות titrated כדי לזהות ליקוי מוטורי החל גדול עד עדינות.
Abstract
התנהגות מעוצבת על ידי פעולות, ופעולות דורשות מיומנויות מוטוריות כגון כוח, קואורדינציה ולמידה. אף אחת מההתנהגויות החיוניות לקיום החיים לא הייתה אפשרית ללא היכולת לעבור מעמדה אחת לאחרת. למרבה הצער, מיומנויות מוטוריות יכולות להיפגע במגוון רחב של מחלות. לכן, חקירת המנגנונים של תפקודים מוטוריים ברמה התאית, המולקולרית והמעגלית, כמו גם הבנת הסימפטומים, הגורמים וההתקדמות של הפרעות מוטוריות, היא חיונית לפיתוח טיפולים יעילים. מודלים עכבר משמשים לעתים קרובות למטרה זו.
מאמר זה מתאר פרוטוקול המאפשר ניטור של היבטים שונים של ביצועים מוטוריים ולמידה בעכברים באמצעות כלי אוטומטי שנקרא סולם ארסמוס. הבדיקה כוללת שני שלבים: שלב ראשוני שבו עכברים מאומנים לנווט בסולם אופקי הבנוי משלבים לא סדירים (“למידה מוטורית עדינה”), ושלב שני שבו מוצג מכשול בדרכה של החיה הנעה. ההפרעה יכולה להיות בלתי צפויה (“למידה מוטורית מאותגרת”) או שקדמה לה צליל שמיעתי (“למידה מוטורית אסוציאטיבית”). המשימה קלה לביצוע ונתמכת באופן מלא על ידי תוכנה אוטומטית.
דו”ח זה מראה כיצד קריאות שונות מהמבחן, כאשר הן מנותחות בשיטות סטטיסטיות רגישות, מאפשרות ניטור עדין של מיומנויות מוטוריות של עכברים באמצעות קבוצה קטנה של עכברים. אנו מציעים כי השיטה תהיה רגישה מאוד להערכת התאמות מוטוריות המונעות על ידי שינויים סביבתיים, כמו גם ליקויים מוטוריים עדינים בשלב מוקדם בעכברים מוטנטיים עם תפקודים מוטוריים פגועים.
Introduction
מגוון בדיקות פותחו כדי להעריך פנוטיפים מוטוריים בעכברים. כל מבחן נותן מידע על היבט מסוים של התנהגות מוטורית1. לדוגמה, מבחן השדה הפתוח מודיע על תנועה כללית ומצב חרדה; בדיקות רוטרוד וקרן הליכה על קואורדינציה ושיווי משקל; ניתוח טביעת רגל עוסק בהליכה; הליכון או גלגל ריצה על פעילות גופנית מאולצת או מרצון; והגלגל המורכב עוסק בלמידת מיומנות מוטורית. כדי לנתח פנוטיפים מוטוריים של עכברים, החוקרים חייבים לבצע בדיקות אלה ברצף, מה שכרוך בהרבה זמן ומאמץ ולעתים קרובות כמה קבוצות של בעלי חיים. אם יש מידע ברמה התאית או המעגלית, החוקר בדרך כלל בוחר בבדיקה שמנטרת היבט קשור ועוקבת משם. עם זאת, פרדיגמות המפלות היבטים שונים של התנהגות מוטורית באופן אוטומטי חסרות.
מאמר זה מתאר פרוטוקול לשימוש בסולם ארסמוס 2,3, מערכת המאפשרת הערכה מקיפה של מגוון תכונות למידה מוטורית בעכברים. היתרונות העיקריים הם יכולת השחזור והרגישות של השיטה, יחד עם היכולת לטיטר קושי מוטורי ולהפריד בין ליקויים בביצועים מוטוריים לבין למידה מוטורית אסוציאטיבית לקויה. הרכיב העיקרי מורכב מסולם אופקי עם שלבים גבוהים (H) ונמוכים (L) לסירוגין המצוידים בחיישנים רגישים למגע המזהים את מיקום העכבר על הסולם. הסולם עשוי 2 x 37 שלבים (L, 6 מ”מ; גובה, 12 מ”מ) במרווחים של 15 מ”מ זה מזה וממוקמים בתבנית מתחלפת שמאל-ימין עם מרווחים של 30 מ”מ (איור 1A). ניתן להזיז שלבים בנפרד כדי ליצור רמות קושי שונות, כלומר, יצירת מכשול (העלאת השלבים הגבוהים ב -18 מ”מ). יחד עם מערכת הקלטה אוטומטית ושיוך שינויים של דפוס הצעד עם גירויים חושיים, סולם ארסמוס בודק למידה מוטורית עדינה והתאמה של ביצועים מוטוריים בתגובה לאתגרים סביבתיים (הופעת שלב גבוה יותר כדי לדמות מכשול, גירוי בלתי מותנה [US]) או קשר עם גירויים חושיים (טון, גירוי מותנה [CS]). הבדיקה כוללת שני שלבים נפרדים, שכל אחד מהם מעריך שיפור בביצועים המוטוריים במשך 4 ימים, שבמהלכם עכברים עוברים סשן של 42 ניסויים רצופים ביום. בשלב הראשוני, עכברים מאומנים לנווט בסולם כדי להעריך למידה מוטורית “עדינה” או “מיומנת”. השלב השני מורכב מניסויים משולבים שבהם מוצג מכשול בצורת מדרגה גבוהה יותר בדרכה של החיה הנעה. ההפרעה יכולה להיות בלתי צפויה להעריך למידה מוטורית “מאותגרת” (ניסויים בארה”ב בלבד) או מוכרזת על ידי טון שמיעתי כדי להעריך למידה מוטורית “אסוציאטיבית” (ניסויים זוגיים).
סולם ארסמוס פותח יחסית לאחרונה 2,3. לא נעשה בו שימוש נרחב מכיוון שהגדרת הפרוטוקול ואופטימיזציה שלו דרשו מאמץ ממוקד ותוכנן במיוחד להעריך למידה אסוציאטיבית תלוית המוח הקטן מבלי לחקור בפירוט את הפוטנציאל שלה לחשוף ליקויים מוטוריים אחרים. עד כה, הוא אומת ביכולתו לחשוף ליקויים מוטוריים עדינים הקשורים לתפקוד לקוי של המוח הקטן בעכברים 3,4,5,6,7,8. לדוגמה, עכברי נוקאאוט מסוג connexin36 (Cx36), שבהם צמתי מרווחים נפגעים בתאי עצב אוליבאריים, מציגים ליקויי ירי עקב היעדר צימוד אלקטרוטוני, אך היה קשה לאתר את הפנוטיפ המוטורי. בדיקה באמצעות סולם ארסמוס הציעה כי תפקידם של נוירונים אוליבאריים נחותים במשימת למידה מוטורית במוח הקטן הוא לקודד קידוד זמני מדויק של גירויים ולהקל על תגובות תלויות למידה לאירועים בלתי צפויים 3,4. עכבר נוקאאוט Fragile X Messenger Ribonucleoprotein 1 (Fmr1), מודל לתסמונת X שביר (FXS), מציג ליקוי קוגניטיבי ידוע יחד עם פגמים קלים יותר ביצירת זיכרון פרוצדורלי. נוקאאוטים של Fmr1 לא הראו הבדלים משמעותיים בזמני צעדים, צעדים שגויים בכל ניסוי או שיפור בביצועים מוטוריים לעומת אימונים בסולם ארסמוס, אך לא הצליחו להתאים את דפוס ההליכה שלהם למכשול שהופיע לפתע בהשוואה לחבריהם לפסולת מסוג פרא (WT), ואישרו ליקויי זיכרון פרוצדורליים ואסוציאטיביים ספציפיים 3,5. יתר על כן, קווים מוטנטיים ספציפיים לתא של עכברים עם פגמים בתפקוד המוח הקטן, כולל תפוקה לקויה של תאי Purkinje, הגברה ופלט של תאי נוירון או גרגיר בשכבה המולקולרית, הציגו בעיות בתיאום המוטורי עם רכישה שונה של דפוסי צעדים יעילים ובמספר הצעדים שננקטו כדי לחצות את הסולם6. פגיעה מוחית בילוד גורמת לליקויי למידה במוח הקטן ולתפקוד לקוי של תאי Purkinje שניתן לזהות גם עם סולם ארסמוס 7,8.
בסרטון זה אנו מציגים מדריך מקיף שלב אחר שלב, המפרט את הגדרת חדר ההתנהגות, פרוטוקול המבחן ההתנהגותי וניתוח הנתונים לאחר מכן. דוח זה נועד להיות נגיש וידידותי למשתמש ותוכנן במיוחד כדי לסייע למצטרפים חדשים. פרוטוקול זה מספק תובנה לגבי שלבים שונים של אימון מוטורי ודפוסים מוטוריים צפויים שעכברים מאמצים. לבסוף, המאמר מציע זרימת עבודה שיטתית לניתוח נתונים באמצעות גישת רגרסיה לא ליניארית רבת עוצמה, עם המלצות והצעות יקרות ערך להתאמה ויישום של הפרוטוקול בהקשרים מחקריים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
סולם ארסמוס מציג יתרונות גדולים להערכת פנוטיפ מוטורי מעבר לגישות הנוכחיות. הבדיקה קלה לביצוע, אוטומטית, ניתנת לשחזור, ומאפשרת לחוקרים להעריך היבטים שונים של התנהגות מוטורית בנפרד באמצעות קבוצת עכברים יחידה. במחקר הנוכחי, יכולת השחזור אפשרה יצירת נתונים חזקים עם מספר קטן של עכברי WT המנצלי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לטכנאי האודיו-ויזואלי ומפיק הווידיאו רבקה דה לאס הראס פונסה, כמו גם לווטרינר הראשי גונזלו מורנו דל ואל, על הפיקוח על שיטות עבודה טובות במהלך ניסויים בעכברים. העבודה מומנה על ידי מענקים מתוכנית המצוינות GVA (2022/8) וסוכנות המחקר הספרדית (PID2022143237OB-I00) לאיזבל פרז-אוטניו.
Materials
| C57BL/6J mice (Mus musculus) | Charles Rivers | ||
| Erasmus Ladder device | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Erasmus Ladder 2.0 software | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| Sigmaplot software | Systat Software, Inc. |
References
- Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user’s guide. Nat. Rev. Neurosci. 10 (7), 519-529 (2009).
- . Available from: https://www.noldus.com/erasmusladder (2023)
- Cupido, A., et al. . Detecting cerebellar phenotypes with the Erasmus ladder[dissertation]. , (2009).
- Van Der Giessen, R. S. Role of olivary electrical coupling in cerebellar motor learning. Neuron. 58 (4), 599-612 (2008).
- Vinueza Veloz, M. F. The effect of an mGluR5 inhibitor on procedural memory and avoidance discrimination impairments in Fmr1 KO mice. Genes Brain Behav. 11 (3), 325-331 (2012).
- Vinueza Veloz, M. F. Cerebellar control of gait and interlimb coordination. Brain Struct. Funct. 220 (6), 3513-3536 (2015).
- Sathyanesan, A., Kundu, S., Abbah, J., Gallo, V. Neonatal brain injury causes cerebellar learning deficits and Purkinje cell dysfunction. Nat. Commun. 9 (1), 3235 (2018).
- Sathyanesan, A., Gallo, V. Cerebellar contribution to locomotor behavior: A neurodevelopmental perspective. Neurobiol. Learn Mem. 165, 106861 (2019).
- McKenzie, I. A. Motor skill learning requires active central myelination. Science. 346 (6207), 318-322 (2014).
- Xiao, L. Rapid production of new oligodendrocytes is required in the earliest stages of motor-skill learning. Nat. Neurosci. 19 (9), 1210-1217 (2016).
