Структурные и биохимические исследования мембранных транспортеров человека требуют миллиграммовых количеств стабильного, интактного и однородного белка. В этой статье мы опишем масштабируемые методы скрининга, экспрессии и очистки переносчиков растворенных веществ человека с использованием генов, оптимизированных для кодонов.
Носители растворенных веществ (SLC) — это мембранные транспортеры, которые импортируют и экспортируют ряд эндогенных и экзогенных субстратов, включая ионы, питательные вещества, метаболиты, нейротрансмиттеры и фармацевтические препараты. Несмотря на то, что они стали привлекательными терапевтическими мишенями и маркерами заболеваний, эта группа белков все еще относительно недооценена современными фармацевтическими препаратами. Проекты по разработке лекарств для этих переносчиков затруднены из-за ограниченных структурных, функциональных и физиологических знаний, в конечном счете, из-за трудностей в экспрессии и очистке этого класса белков, встроенных в мембраны. В этой статье мы демонстрируем методы получения высокочистых, миллиграммовых количеств белков-переносчиков SLC человека с использованием кодон-оптимизированных последовательностей генов. В сочетании с систематическим изучением конструкционного дизайна и высокопроизводительной экспрессии, эти протоколы обеспечивают сохранение структурной целостности и биохимической активности белков-мишеней. Мы также выделяем важнейшие этапы экспрессии эукариотических клеток, аффинной очистки и хроматографии с исключением размера этих белков. В конечном счете, этот рабочий процесс позволяет получить чистые, функционально активные и стабильные белковые препараты, пригодные для определения структуры с высоким разрешением, исследований переноса, анализа вовлечения малых молекул и высокопроизводительного скрининга in vitro .
Мембранные белки уже давно являются мишенью как для исследователей, так и для фармацевтической промышленности. Из них растворенные носители (SLC) представляют собой семейство из более чем 400 вторичных генов-переносчиков, закодированных в геноме человека1. Эти переносчики участвуют в импорте и экспорте многочисленных молекул, включая ионы2, нейротрансмиттеры3, липиды 4,5,6,7, аминокислоты8, питательные вещества 9,10,11 и фармацевтические препараты 12. При такой широте субстратов эти белки также вовлечены в целый ряд патофизиологий через транспорт токсинов13, транспорт и ингибирование наркотиками 14,15 или вредные мутации16. Бактериальные гомологи послужили прототипами фундаментального транспортного механизма нескольких семейств SLC 17,18,19,20,21,22,23,24,25. В отличие от белков человека, прокариотические ортологи часто лучше экспрессируются в хорошо изученной системе экспрессии Escherichia coli 26,27 и более стабильны в более мелких детергентах, которые дают хорошо упорядоченные кристаллы для рентгеновской кристаллографии28. Однако последовательности и функциональные различия затрудняют использование этих отдаленно родственных белков для разработки лекарств29,30. Следовательно, для расшифровки механизма действия препаратов, нацеленных на SLC 31,32,33,34,35, часто требуется непосредственное изучение белка человека. Несмотря на то, что недавние достижения в области криоэлектронной микроскопии (Крио-ЭМ) позволили охарактеризовать структурные СЛК в условиях, приближенных к нативным36,37, трудности с экспрессией и очисткой этих белков остаются проблемой для разработки таргетной терапии и диагностики.
Чтобы решить эту проблему, консорциум RESOLUTE (re-solute.eu) разработал ресурсы и протоколы для крупномасштабной экспрессии и очистки белков семейства SLCчеловека 38. Начав с кодон-оптимизированных генов, мы разработали методы высокопроизводительного клонирования и скрининга SLC-конструкций. Эти методы систематически применялись ко всему семейству SLC, гены клонировались в систему вирусной экспрессии BacMam, а экспрессия белка тестировалась на клеточных линиях человека39 на основе ранее описанных методов высокопроизводительного клонирования и тестирования экспрессии40. Таким образом, ген SLC клонируется из плазмиды pDONR221 в вектор pHTBV1.1. Эта конструкция впоследствии используется для транспонирования интересующего гена в бакмидный вектор для трансфекции клеток насекомых, который включает промотор цитомегаловируса и элементы энхансера для экспрессии в клетках млекопитающих. Полученный бакуловирус может быть использован для трансдукции клеток млекопитающих для экспрессии белка-мишени SLC.
Кроме того, мы разработали стандартизированные методы для крупномасштабной экспрессии и стабильной очистки выбранных SLC (рис. 1). Этот протокол включает в себя несколько контрольных точек, что облегчает эффективное устранение неполадок и сводит к минимуму вариативность между экспериментами. В частности, рутинный мониторинг экспрессии и локализации белков, а также мелкомасштабная оптимизация условий очистки для отдельных мишеней были поддержаны метками стрептококка и зеленого флуоресцентного белка (GFP)41,42.
В конечном счете, эти химически чистые и структурно однородные образцы белков могут быть использованы для структурного определения с помощью рентгеновской кристаллографии или криоэлектронной микроскопии (Крио-ЭМ), биохимических анализов взаимодействия с мишенями, иммунизации для генерации связующего и внеклеточных функциональных исследований путем восстановления в химически определенные липосомы.
Разработка SLC-таргетной терапии по-прежнему затруднена из-за отсутствия систематической характеристики функции транспортера. Это привело к непропорционально меньшему количеству препаратов, нацеленных на этот класс белков по сравнению с GPCR и ионными каналами63, несмотря н…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была выполнена в рамках проекта RESOLUTE. Компания RESOLUTE получила финансирование от Совместного предприятия «Инициатива по инновационным лекарственным средствам 2» в рамках грантового соглашения No 777372. Это совместное предприятие получает поддержку от программы исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» и EFPIA. Эта статья отражает только точку зрения авторов, и ни ИМИ, ни Европейский Союз, ни EFPIA не несут ответственности за любое использование содержащейся в ней информации. Плазмида pHTBV была любезно предоставлена профессором Фредериком Бойсом (Frederick Boyce) из Гарварда.
3C protease | Produced in-house | ||
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators | Sartorius | VS0242 | |
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside | Anatrace | C325 | CYMAL-5 |
96-well bacmid purification kit | Millipore | LSKP09604 | Montage Plasmid Miniprep |
96-well block (2 mL) | Greiner Bio-One | 780271 | |
Adhesive plastic seals | Qiagen | 19570 | Tape Pads |
Agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL |
Benzonase DNAse | Produced in-house | ||
BisTris | Sigma Aldrich | B9754 | |
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt | Anatrace | CH210 | CHS |
Cobalt metal affinity resin | Takara Bio | 635653 | TALON Metal Affinity Resin |
D(+)-Biotin | Sigma Aldrich | 851209 | |
Dextran-agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL |
Digitonin | Apollo Scientific | BID3301 | |
Dounce tissue grinder (40 mL) | DWK Life Sciences | 357546 | |
EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 4693132001 | cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
Fos-Choline-12 | Anatrace | F308S | FS-12 |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
Glyco-diosgenin | Anatrace | GDN101 | GDN |
Gravity flow columns | Cole-Parmer | WZ-06479-25 | |
HEK293 medium | Thermo Fisher | 12338018 | FreeStyle 293 medium |
HEPES | Apollo Scientific | BI8181 | |
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column | Sepax | 231300-4615 | Unix-C SEC-300 4.6 x 150 |
Imidazole | Sigma Aldrich | 56750 | |
Insect transfection reagent | Sigma Aldrich | 71259 | Reagent |
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG310 | LMNG |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
Micro-expression shaker | Glas-Col | 107A DPMINC24CE | |
NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
n-Decyl-β-D-Maltoside | Anatrace | D322 | DM |
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | DDM |
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide | Anatrace | D360 | LDAO |
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | N324S | NG |
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | O311D | OGNG |
Octaethylene Glycol Monododecyl Ether |
Anatrace | O330 | C12E8 |
Octyl Glucose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG311 | OGNG |
Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | DPBS |
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether | Anatrace | AP1210 | C12E10 |
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether | Anatrace | APO129 | C12E9 |
Porous seal for tissue culture plates | VWR | 60941-084 | Rayon Films for Biological Cultures |
Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
Recombination enzyme mix | Thermo Fisher | 11791020 | Gateway LR Clonase II |
Serum-free insect media | Gibco | 10902088 | Sf-900 II serum-free media |
Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | 303410 | |
Sonicator 24-head probe | Sonics | 630-0579 | |
Sonicator power unit | Sonics | VCX 750 | |
Strep-Tactin resin | IBA Life Sciences | 2-5030-025 | Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
Sucrose Monododecanoate | Anatrace | S350 | DDS |
Suspension-adapted HEK293 cells | Thermo Fisher | A14527 | Expi293F |
Transfection reagent | Sigma Aldrich | 70967 | GeneJuice Transfection Reagent |