構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

膜タンパク質は、長い間、研究者や製薬業界の標的となってきました。これらのうち、溶質キャリア(SLC)は、ヒトゲノム1内にコードされている400を超える二次トランスポーター遺伝子のファミリー^です。これらのトランスポーターは、イオン²、神経伝達物質³、脂質4,5,6,7、アミノ酸⁸、栄養素9,10,11、医薬品¹²など、多数の分子の輸出入に関与しています。このような幅広い基質により、これらのタンパク質は、毒素の輸送13、乱用薬物の輸送と阻害^14,15、または有害な突然変異¹⁶を通じて、さまざまな病態生理学にも関与しています。細菌の相同体は、いくつかのSLCファミリーの基本的な輸送メカニズムのプロトタイプとして機能してきました¹⁷、^18、19、20、21、^22、23、^24、25。ヒトタンパク質とは対照的に、原核生物のオルソログは、よく理解されている大腸菌発現系でよりよく発現することが多く^26,27、X線結晶構造解析用の整然とした結晶を生成する小さな界面活性剤でより安定しています²⁸。しかし、配列と機能の違いは、これらの遠縁タンパク質の創薬への使用を複雑にします^29,30。したがって、SLCを標的とする薬物の作用機序を解読するために、ヒトタンパク質の直接的な研究がしばしば必要になります³¹、^32、33、^34、35。クライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)の最近の進歩により、より天然に近い条件でのSLCの構造特性評価が可能になりました^が36,37、これらのタンパク質の発現と精製の難しさは、標的治療薬や診断薬の開発にとって依然として課題です。

この課題を軽減するため、RESOLUTE コンソーシアム (re-solute.eu) は、ヒト SLC ファミリータンパク質の大規模な発現と精製のためのリソースとプロトコルを開発しました³⁸。コドン最適化遺伝子を皮切りに、SLCコンストラクトのハイスループットクローニングおよびスクリーニング法を開発しました。これらの方法はSLCファミリー全体に系統的に適用され、遺伝子はBacMamウイルス発現系にクローニングされ、タンパク質発現は、以前に記述されたハイスループットクローニングおよび発現試験の方法に基づいてヒト細胞株で試験された³⁹。要約すると、SLC遺伝子はpDONR221プラスミドからpHTBV1.1ベクターにクローニングされます。その後、このコンストラクトを使用して、哺乳類細胞で発現するためのサイトメガロウイルスプロモーターおよびエンハンサー要素を含む昆虫細胞をトランスフェクションするためのバクミドベクターに目的の遺伝子を転置します。得られたバキュロウイルスは、標的SLCタンパク質の発現のために哺乳類細胞を形質導入するために使用できます。

さらに、選択したSLCの大規模発現と安定精製のための標準化された方法を開発しました(図1)。このプロトコルには、効果的なトラブルシューティングを容易にし、実験間のばらつきを最小限に抑えるための複数のチェックポイントが含まれています。特に、タンパク質の発現と局在のルーチンモニタリング、および個々のターゲットの精製条件の小規模な最適化は、連鎖球菌および緑色蛍光タンパク質(GFP)タグによって支援されました^41,42。

最終的に、これらの化学的に純粋で構造的に均質なタンパク質サンプルは、X線結晶構造解析またはクライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)による構造決定、生化学的ターゲットエンゲージメントアッセイ、結合剤生成のための免疫、および化学的に定義されたリポソームへの再構成による無細胞機能研究に使用できます。