Burada, iPSC’den türetilen nöronların ve astrositlerin 3D biyobaskılı kokültürlerini üretmek için bir protokol sunuyoruz. 96 veya 384 oyuklu formatlarda bir hidrojel iskele içinde üretilen bu kokültür modeli, 7 gün içinde yüksek baskı sonrası canlılık ve nörit büyümesi gösterir ve her iki hücre tipi için olgunluk belirteçlerinin ekspresyonunu gösterir.
Bir hücre modelinin ilaç taraması için uygun olması için, sistemin verimli bir geliştirme süresine sahip olmasının yanı sıra verim ve homojenlik gereksinimlerini karşılaması gerekir. Ancak, yayınlanan birçok 3B model bu kriterleri karşılamamaktadır. Bu nedenle, erken ilaç keşif uygulamalarında kullanışlılıklarını sınırlar. Üç boyutlu (3D) biyo-baskı, geliştirme süresini hızlandırmak, standardizasyonu artırmak ve verimi artırmak için 3D modellerin geliştirilmesine uygulanabilen yeni bir teknolojidir. Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı glutamaterjik nöronların ve astrositlerin 3D biyobaskılı kokültür modellerini geliştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu kokültürler, biyoaktif peptitler, tam uzunlukta hücre dışı matris (ECM) proteinlerinden oluşan bir hidrojel matrisi içine ve 1.1 kPa’lık bir fizyolojik sertliğe sahiptir. Model, 96 kuyucuklu ve 384 kuyucuklu formatlarda hızlı bir şekilde kurulabilir ve ortalama %72’lik bir baskı sonrası canlılık sağlar. Bu modeldeki astrosit-nöron oranının, insan beyni için fizyolojik aralık içinde olan 1: 1.5 olduğu gösterilmiştir. Bu 3D biyobaskılı hücre popülasyonları ayrıca olgun nöral hücre tipi belirteçlerinin ekspresyonunu ve kültürden sonraki 7 gün içinde nörit ve astrosit projeksiyonlarının büyümesini gösterir. Sonuç olarak, bu model, nörit büyüme testlerinin yanı sıra hücre boyaları ve immün boyama teknikleri kullanılarak analiz için uygundur. Bu fizyolojik olarak temsili modelleri geniş ölçekte üretme yeteneği, onları sinirbilim hedefleri için orta ila yüksek verimli tarama testlerinde kullanım için ideal hale getirir.
İlaç keşif endüstrisinde merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıklarına yönelik araştırmalar genişliyor1. Bununla birlikte, epilepsi, şizofreni ve Alzheimer hastalığı gibi birçok yaygın CNS hastalığının hala iyileştirici tedavileri yoktur 2,3,4. CNS hastalıklarında etkili terapötiklerin eksikliği, en azından kısmen, beynin doğru in vitro modellerinin eksikliğine bağlanabilir5. Bu, mevcut in vitro modeller ile in vivo veriler arasında bir translasyon boşluğuna ve ardından araştırma çabalarında bir darboğaza neden oldu.
Bu translasyonel boşluktan hareketle, son yıllarda nöral organoidler, nörosferoidler ve iskele tabanlı modeller dahil olmak üzere yeni 3D hücre modellerinin geliştirilmesinde önemli bir artış olmuştur6. Bu modellerin 3B yapısı, biyomekanik stresler, hücre-hücre temasları ve beyin hücre dışı matrisi (ECM) dahil olmak üzere nöral mikro çevrenin özetlenmesine yardımcı olur7. Beyin ECM’si, nöronlar, astrositler, oligodendrositler ve nörovasküler ünite7 dahil olmak üzere nöral hücre tipleri arasındaki boşluğu kaplayan nörofizyolojinin dinamik bir unsurudur. Beyin ECM’sinin rekapitülasyonunun nöronal morfolojiyi ve nöronal ateşlemeyi etkilediği gösterilmiştir ve beynin birçok karmaşık 3D modeli, ECM proteinlerinin nöral hücre tipleri 8,9,10,11 tarafından biriktirildiğini göstermiştir. İskele tabanlı modeller, beyin ECM12’yi temsil eden gözenekli bir sentetik veya biyolojik hidrojel matrisi içinde süspanse edilmiş olgun nöral kokültürlerden oluşur. Organoid ve sferoid sistemlerden farklı olarak, iskele tabanlı 3D modeller, mevcut ECM proteinlerinin özelleştirilmesine izin verir ve biyomekanik stresleri taklit etmek için hidrojel sertliğinin ayarlanabilirliği avantajına sahiptir13,14.
3D nöral modellerin ezici bir çoğunluğu beyin mikroçevresinin artan bir özetini gösterse de, tüm modeller ilaç keşif uygulamalarını uygulamak için uygun değildir15. Bir 3D modelin endüstriyel süreçlere uygulanabilmesi için, sistemin tarama uygulamaları için verim gereksinimlerini karşılaması ve nispeten kısa bir geliştirme süresinesahip olması gerekir 16. 3D Biyobaskı, insan hatasının neden olduğu değişkenliğin ortadan kaldırılmasının yanı sıra hızlı geliştirme süresi, artan verim ve daha yüksek düzeyde hassas kontrol ile 3D iskele tabanlı nöral modeller oluşturma potansiyeli sunan yeni bir teknolojidir17. Bu protokol, bir hidrojel iskelesinde insan iPSC’den türetilmiş glutamaterjik nöronların ve astrositlerin 3 boyutlu bir kokültür modelini sunar. Bu hidrojel iskelesi, mimetik bir biyomekanik sertlik içinde fizyolojik olarak temsili biyoaktif peptitler (RGD, IKVAV, YIGSR) ve ECM proteinleri içerir. Bu tam uzunluktaki ECM proteinleri, insan korteksinde bol miktarda bulunan tam uzunlukta laminin-211 ve hyaluronik asidi içerir ve in vivo ölçümlere göre 1.1 kPa sertliğesahiptir 18. Bu model, ilaç keşfi için pratiklik ile tasarlanmıştır ve nörit büyüme tahlillerinin yanı sıra hücre boyaları ve antikorlarla görüntüleme teknikleri kullanılarak tarama analizine uygun 96 oyuklu veya 384 oyuklu plaka formatında bir 3D biyoyazıcı kullanılarak oluşturulmuştur. Hücreler, kültürden sonraki 7 gün içinde nöral hücre tipi belirteçlerinin ekspresyonunu ve nörit ve astrositik projeksiyonların büyümesini gösterir. Bu nedenle, bu protokol, ilaç keşif uygulamalarında kullanılmak üzere yüksek verimli bir 3D nöral kokültür modeli geliştirme metodolojisini sunacaktır.
Şekil 1: 3D biyobaskı kokültürleri için kullanılan metodolojiye açıklayıcı bir genel bakış. İnsan iPSC’den türetilen nöronlar ve astrositler, biyoaktif peptitler içeren aktivatör ve biyomürekkep çözeltileri ile birleştirilir ve isteğe bağlı biyo-baskı teknolojisi kullanılarak 96 kuyucuklu veya 384 oyuklu formatlarda hidrojel iskelelere biyolojik olarak basılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
CNS’nin doğru modellerine duyulan ihtiyaç hiç bu kadar yüksek olmamıştı ve iki boyutlu (2D) geleneksel hücre kültürü modellerinin sınırlamaları, son yıllarda bir nesil karmaşık CNS modelini yönlendirdi19. Bununla birlikte, nöral hücre tipleri ve ECM arasındaki etkileşimleri temsil eden birçok karmaşık 3B model, bu modellerin endüstriyel süreçlerde uygulanmasını engelleyecek sınırlamalara sahiptir 6,20,21. Bu protokolde, 96 kuyucuklu ve 384 kuyucuklu formatlarda biyoaktif bir hidrojel iskelesi oluşturmak için 3D biyobaskı teknolojisini kullanarak bu sınırlamaların bazılarını çözmeyi amaçlayan, insan iPSC’den türetilmiş nöronların ve astrositlerin bir 3D kokültür modelini geliştiriyoruz.
Bu modelleri geliştirme metodolojisi, plaka haritası tasarım yazılımı, otomatik olarak oluşturulan baskı protokolleri ve biyoyazıcıdan yönlendirilen baskı süreci aracılığıyla basitleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu protokolde kullanılan hassas iPSC türevi hücre tiplerinin hassas doğası nedeniyle, çözdürme ve kültürde aşağıdaki kritik adımlara dikkat edilmelidir. İlk olarak, ROCK inhibitörünün (ROCKi) dahil edilmesi, biyo-baskı işlemi boyunca ve erken kültür sırasında çeşitli faydalara sahiptir. Hücre çözülmesi, nöronların stres tepkisi yaşayabileceği kritik bir noktadır ve uygun olmayan çözülme protokolleri hayatta kalma şansını azaltabilir22. Tipik olarak hücrelerin çözülmesi, ortam eklenmesi ve hücrelerin inkübatör sıcaklığına mümkün olduğunca verimli bir şekilde yükseltilmesi önerilir23. Bununla birlikte, bu protokolde açıklanan biyo-baskı işlemi sırasında, nöronların ve astrositlerin ortam yerine bir aktivatör çözeltisinde yeniden süspanse edilmesi gerekir ve hücreler, baskı çalışmasının sonuna kadar (çözülme sonrası 30 dakikaya kadar) oda sıcaklığının üzerine çıkarılmayacaktır. Bu nedenle, çözüldükten hemen sonra ROCKi’nin ortama eklenmesi ve bunun iki santrifüj adımı sırasında (2.1–2.7 ve 1.3.15-1.3.20 adımları) dahil edilmesi, hücre stres yollarını inhibe etmek için zorunludur, bu da daha düşük canlılık seviyelerine neden olur24. Ayrıca, ROCKi’nin nörit büyümesini teşvik ettiği ve nöronal olgunlaşmayı iyileştirdiği gösterilmiştir25. Bu nedenle, biyobaskı sonrası 48 saat boyunca ROCKi takviyesine devam edilir. Bununla birlikte, hücreler tahlil için kullanılmadan önce sonraki ortam değişiklikleri sırasında tam yıkamayı sağlamak için 48 saat sonra ROCKi takviyesinin çıkarılması zorunludur.
Kritik dikkat gerektiren bir diğer adım, baskı sonrası medya ekleme ve medya değişiklikleri sırasındadır (adım 2.8-2.13). Biyobaskılı hidrojel iskele, gri maddeye eşdeğer, yalnızca 1,1 kPa’lık eşdeğer bir biyomekanik sertliğe sahiptir. Adım 2.10’da açıklandığı gibi, rahatsızlığı önlemek için ortam ekleme ve aspirasyon sırasında kuyunun kenarına nazikçe pipetlemek çok önemlidir. Bu, jel seviyesinin toplam kuyu hacminin daha yüksek bir oranını kapladığı 384 oyuklu plakalar için özellikle önemlidir. Bu yöntem, hücrelerin kenar kaldırmasını ve nörit büyümelerinin kesilmesini önlemek için 2D kontrol kuyularında da kullanılmalıdır. Yazarlar ayrıca, iPSC’den türetilmiş hücre kültürleri için kullanılan bir biyogüvenlik kabinininkine eşdeğer bir dikkatle ele alınması gereken biyo-yazıcı içindeki steril tekniğin önemini vurgulamak istemektedir. Bu, yeşil ışık yakma ve baskı prosedürlerinde kullanılan %70 EtOH ve dH2O’nun steril filtrelenmesini, elleri biyoyazıcının içine ve dışına hareket ettirirken kartuşların ve plakaların kapaklarının tutulmasını ve baskıdan önce ve sonra biyoyazıcının içindeki yüzeylerin %70 etanol mendille dekontamine edilmesini içerir.
Bu modeli geliştirmek için seçilen biyomürekkep ve aktivatör solüsyonlarından oluşan biyo-baskılı hidrojel iskelesi, RASTRUM biyoyazıcısında kullanılmak üzere Inventia Life Science tarafından geliştirilen bir dizi biyomürekkep ve aktivatör solüsyonundan seçilmiştir. Laminin ve hyaluronik asit, aksonal rehberlik, sinaps oluşumu ve perinöronal ağın oluşumundaki rolleri nedeniyle iPSC kaynaklı nöronal olgunlaşma ile ilgili moleküller olarak tanımlanmıştır26,27. Ayrıca, daha düşük yoğunluklu hidrojellerin nöronlardan12 daha iyi nörit büyümesi sağladığı gösterildiğinden, 1.1 kPa’lık bir biyomekanik sertlik seçilmiştir. Şirket içinde veya farklı bir ticari tedarikçiden farklılaştırılan nöronlar ve astrositler kullanılarak protokolde değişiklikler yapılırsa, en destekleyici hidrojel iskelesini belirlemek için bir matris seçim testi yapılması önerilir15. Ayrıca, optimum canlılığı sağlamak ve hidrojel aşırı kalabalıklaşmasını önlemek için hücre kaynaklarında değişiklikler yapılırsa hücre yoğunluğunun da optimize edilmesi gerekebilir. Biyoyazıcı işleviyle ilgili tüm değişiklikler ve sorun giderme için yazarlar, üreticilerle iletişime geçmenizi ve üretici protokollerine başvurmanızı önerir.
CNS, hepsi farklı beyin nişlerinde bulunan ve nöral fonksiyona katkıda bulunan belirli rollere sahip çok çeşitli nöronal alt tipler ve glial hücreler içerir28. Bu geniş kapsam bağlamında, bu model yalnızca en bol bulunan iki hücre tipini (astrositler ve uyarıcı glutamaterjik nöronlar) temsil eder. Mikroglia, oligodendrositler ve kan-beyin bariyeri oluşturan endotel hücreleri gibi önemli hücre tipleri bu sistemden çıkarılır. Mikroglia’nın dahil edilmesi, nöroimmün etkileşimlere odaklanmada önemli olabilir ve oligodendrositler, merkezi miyelinasyonu etkileyen hastalıklarda ilgi çekici olabilir. Patolojideki rollerine ek olarak, kan-beyin bariyeri oluşturan endotel hücreleri gibi hücreler, bu modelin farmakokinetik tahliller için kullanımını etkileyebilecek ilaç metabolize edici enzimler salgılar29. Modelin bir başka sınırlaması, astrositlerin nöronlara oranı olabilir; Astrositlerin nöronlara oranı, beyin bölgeleri arasında büyük farklılıklar gösterir ve önerilen değerler 1:1 ile 1:330,31 arasındadır. Bu model, nöronlara yaklaşık 1:1.5 astrosit oranına sahiptir; Bu nedenle, bu model, beyaz cevher alanları30 gibi astrositlerin daha bol olduğu beyin bölgelerini modellemekle ilgili olmayabilir.
Son yıllarda 3D biyo-baskılı kokültür modelleri geliştirmek için başka protokoller de yayınlanmıştır. Sullivan ve ark., 2021 tarafından yayınlanan bir yayın, 2D kültürlere kıyasla yüksek baskı sonrası canlılık ve nöronal fonksiyonun iyileştirildiğini gösteren, iPSC’den türetilmiş nöral progenitör hücreleri kullanan bir 3D biyobaskılı nöral model sundu32. Ancak bu protokolde hücre kaynağı olarak nöral progenitör hücreler kullanılmış ve 4 hafta kültürde tutulmuştur. Bu protokolde, ticari olarak temin edilebilen iPSC türevi glutamaterjik nöronlar ve astrositler kullanıldı. Bu, 7 gün gibi kısa bir sürede birlikte kültürlenmiş hücrelerden oluşan bir 3D ağın kurulmasına izin verir; Nörit büyüme analizinin gösterdiği gibi, nörit büyümesi 24 saat içinde başlar ve hücre büyümesinin izlendiği 156 saatlik periyot boyunca doğrusal bir şekilde devam eder. Bu ağların hızlı bir şekilde kurulması kısmen, 2D kültürde bile 7 gün içinde olgun nöronal alt tip belirteçlerinin ekspresyonunu gösteren NGN2’nin optimize edilmiş doksisiklin ile indüklenebilir gen ekspresyonunu kullanan glutamaterjik nöronların kullanımına bağlanabilir33. Bu tekniği kullanarak bu büyüme periyodunun kısaltılması, biyofarmasötik endüstrisinde modellerin uygulanması için önemlidir, çünkü tahlil geliştirme, hücre modellerinin hızlı bir şekilde geri dönüşünü ve geliştirilmesini gerektirir15.
Sonuç olarak, bu model, tarama amacıyla hızlı ve uygun bir şekilde kurulan bir 3D nöron ve astrosit modeli için potansiyel göstermektedir. Bu model türü için gelecekteki uygulamalar, hasta veya gen düzenlenmiş hastalık iPSC hatlarını kullanarak farklı hastalıklara genişleme fırsatı ile farklı CNS hastalıklarında ilaç keşif çabaları için olabilir. Ayrıca, doksisiklin ile indüklenebilir NGN2 ekspresyonu iPSC’den türetilen glutamaterjik nöronların kullanımı, hücrelerin daha kısa sürede olgunluğa ulaşmasını sağlar ve bu, nörodejenerasyon araştırmaları için yaşlanan beynin modellerini geliştirmek için kullanılabilir. Bu sistem, mikroglia ve oligodendrositler dahil olmak üzere kokültürde ek hücre tiplerinin kullanılmasıyla da genişletilebilir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, Alex Volkerling, Martin Engel ve Rachel Bleach’e protokolün geliştirilmesindeki yardımları ve makaleyle ilgili geri bildirimleri için teşekkür eder.
2-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350010 | |
384-well plate | PerkinElmer | 6057300 | |
96-well plate | PerkinElmer | 6055300 | |
Activator fluid F299 | Inventia Life Science | N/A | |
Activator fluid F3 | Inventia Life Science | N/A | |
B27 (50x) minus Vit A | Thermofisher | 12587010 | |
Bioink fluid F261 | Inventia Life Science | N/A | |
Bioink fluid F32 | Inventia Life Science | N/A | |
Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D5207 | |
GlutaMAX (100x) | Thermofisher | 35050061 | |
Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150115 | |
Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
Hoechst | Abcam | ab228551 | |
Human BDNF Recombinant Protein | Thermofisher | PHC7074 | |
Human NT3 Recombinant Protein | Thermofisher | PHC7036 | |
iCell Astrocytes | Fujifilm CDI | 1434 | |
INCell Analyser 6500HS | Molecular Devices | N/A | high content imaging system |
Incucyte S3 | Sartorius | N/A | |
ioGlutamatergic Neurons (Large vial) | Bit.bio | e001 | |
Laminin (1 mg/mL) | Sigma Aldrich | L2020 | |
Live/dead kit (Calcein-AM, Ethidium homo-dimer-1) | Invitrogen | L3224 | |
Mouse anti-BIII tubulin NL637 conjugated | R&D systems | SC024 | |
Neurobasal media | Thermofisher | 21103049 | |
Normal Donkey Serum | Abcam | ab7475 | |
NucBlue Live (Hoechst 33342) | Thermofisher | R37605 | |
Opti-MEM | Thermofisher | 11058021 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
PEI 50% in H2O | Sigma Aldrich | 181978 | |
Pierce Borate Buffer 20x | Thermofisher | 28341 | |
Prism | GraphPad | Data analysis software | |
Rabbit anti-ionotropic glutamatre receptor 2 (GluR2) | Abcam | ab206293 | |
RASTRUM(TM) Bioprinter | Inventia Life Science | N/A | Bioprinter |
RASTRUM(TM) Bioprinter Cartridges | Inventia Life Science | N/A | Bioprinter Cartridges |
RASTRUM(TM) Targeting plate | Inventia Life Science | N/A | Targeting plate |
Rho kinase (ROCK) inhibitor | Abcam | ab120129 | |
Sheep anti-GFAP NL493 conjugated | R&D systems | SC024 | |
Signals Image Artist | PerkinElmer | N/A | Image analysis platform |
Triton X-100 | Thermofisher | HFH10 | |
Zeiss Axio Observer | Zeiss | N/A | Inverted microscope platform |