هنا ، نقدم بروتوكولا لإنتاج 3D-bioprint cocultures من الخلايا العصبية والخلايا النجمية المشتقة من iPSC. يوضح نموذج الاستزراع المشترك هذا ، الذي تم إنشاؤه داخل سقالة هيدروجيل بتنسيقات 96 أو 384 بئرا ، قابلية عالية للبقاء بعد الطباعة ونمو الخلايا العصبية في غضون 7 أيام ويظهر التعبير عن علامات النضج لكلا النوعين من الخلايا.
لكي يكون نموذج الخلية قابلا للتطبيق لفحص الأدوية ، يجب أن يفي النظام بمتطلبات الإنتاجية والتجانس إلى جانب وجود وقت تطوير فعال. ومع ذلك ، فإن العديد من نماذج 3D المنشورة لا تفي بهذه المعايير. هذا بالتالي يحد من فائدتها في تطبيقات اكتشاف الأدوية المبكرة. الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد (3D) هي تقنية جديدة يمكن تطبيقها على تطوير نماذج ثلاثية الأبعاد لتسريع وقت التطوير وزيادة التوحيد القياسي وزيادة الإنتاجية. هنا ، نقدم بروتوكولا لتطوير نماذج زراعة مشتركة مطبوعة بيولوجيا 3D للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (iPSC) المشتقة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية. يتم تضمين هذه الزراعات المشتركة داخل مصفوفة هيدروجيل من الببتيدات النشطة بيولوجيا ، وبروتينات مصفوفة خارج الخلية كاملة الطول (ECM) ، وبصلابة فسيولوجية تبلغ 1.1 كيلو باسكال. يمكن إنشاء النموذج بسرعة بتنسيقات 96 بئرا و 384 بئرا وينتج متوسط صلاحية ما بعد الطباعة بنسبة 72٪. تظهر نسبة الخلايا النجمية إلى الخلايا العصبية في هذا النموذج على أنها 1: 1.5 ، وهي ضمن النطاق الفسيولوجي للدماغ البشري. تظهر مجموعات الخلايا المطبوعة بيولوجيا 3D هذه أيضا تعبيرا عن علامات نوع الخلايا العصبية الناضجة ونمو إسقاطات الخلايا العصبية والنجمية في غضون 7 أيام من الثقافة. نتيجة لذلك ، هذا النموذج مناسب للتحليل باستخدام أصباغ الخلايا وتقنيات التلوين المناعي جنبا إلى جنب مع مقايسات نمو الخلايا العصبية. إن القدرة على إنتاج هذه النماذج التمثيلية من الناحية الفسيولوجية على نطاق واسع تجعلها مثالية للاستخدام في فحوصات فحص الإنتاجية المتوسطة إلى العالية لأهداف علم الأعصاب.
تتوسع الأبحاث في أمراض الجهاز العصبي المركزي (CNS) في صناعة اكتشاف الأدوية1. ومع ذلك ، فإن العديد من أمراض الجهاز العصبي المركزي السائدة مثل الصرع والفصام ومرض الزهايمر لا تزال لا تحتوي على علاجات علاجية2،3،4. يمكن أن يعزى عدم وجود علاجات فعالة عبر أمراض الجهاز العصبي المركزي ، جزئيا على الأقل ، إلى عدم وجود نماذج دقيقة في المختبر للدماغ5. وقد أدى ذلك إلى فجوة انتقالية بين النماذج الحالية في المختبر والبيانات في الجسم الحي وعنق الزجاجة اللاحق في الجهود البحثية.
مدفوعة بهذه الفجوة الانتقالية ، كانت هناك زيادة كبيرة في تطوير نماذج خلايا 3D الجديدة خلال السنوات الأخيرة ، بما في ذلك الكائنات العضوية العصبية ، والكائنات العصبية، والنماذج القائمة على السقالات6. يساعد الهيكل ثلاثي الأبعاد لهذه النماذج في تلخيص البيئة الدقيقة العصبية ، بما في ذلك الضغوط الميكانيكية الحيوية ، والاتصالات بين الخلايا والخلايا ، والمصفوفة خارج الخلية في الدماغ (ECM) 7. ECM في الدماغ هو عنصر ديناميكي في الفيزيولوجيا العصبية يشغل المساحة بين أنواع الخلايا العصبية ، بما في ذلك الخلايا العصبية والخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن والوحدة الوعائية العصبية7. وقد تبين أن تلخيص ECM في الدماغ يؤثر على مورفولوجيا الخلايا العصبية وإطلاق الخلايا العصبية ، وقد أظهرت العديد من نماذج 3D المعقدة للدماغ ترسب بروتينات ECM حسب أنواع الخلايا العصبية8،9،10،11. تتكون النماذج القائمة على السقالات من ثقافات عصبية ناضجة معلقة في مصفوفة هيدروجيل اصطناعية أو بيولوجية مسامية تمثل ECM12 في الدماغ. على عكس الأنظمة العضوية والكروية ، تسمح نماذج 3D القائمة على السقالات بتخصيص بروتينات ECM الموجودة ولها فائدة إضافية تتمثل في قابلية ضبط صلابة الهيدروجيل لتقليد الضغوط الميكانيكية الحيوية13,14.
على الرغم من أن الغالبية العظمى من النماذج العصبية ثلاثية الأبعاد تظهر زيادة تلخيص البيئة المكروية للدماغ ، إلا أن جميع النماذج ليست مناسبة تماما لتنفيذ تطبيقات اكتشاف الأدوية15. لكي يتم تنفيذ نموذج ثلاثي الأبعاد في العمليات الصناعية ، يجب أن يفي النظام بمتطلبات الإنتاجية لفحص التطبيقات وأن يكون له وقت تطوير قصير نسبيا16. 3D Bioprinting هي تقنية جديدة توفر إمكانية إنشاء نماذج عصبية قائمة على سقالات ثلاثية الأبعاد مع وقت تطوير سريع ، وزيادة الإنتاجية ، ومستويات أعلى من التحكم الدقيق ، إلى جانب إزالة التباين الناجم عن الخطأ البشري17. يقدم هذا البروتوكول نموذج 3D للثقافة المشتركة للخلايا العصبية البشرية المشتقة من iPSC والخلايا النجمية في سقالة هيدروجيل. تحتوي سقالة الهيدروجيل هذه على ببتيدات نشطة بيولوجيا ممثلة من الناحية الفسيولوجية (RGD ، IKVAV ، YIGSR) وبروتينات ECM ضمن صلابة ميكانيكية حيوية محاكاة. تشتمل بروتينات ECM كاملة الطول هذه على laminin-211 كامل الطول وحمض الهيالورونيك ، الوفير في القشرة البشرية ، مع صلابة تبلغ 1.1 كيلو باسكال بما يتماشى مع القياسات في الجسم الحي 18. تم تصميم هذا النموذج مع التطبيق العملي لاكتشاف الأدوية ، ويتم إنشاؤه باستخدام طابعة حيوية ثلاثية الأبعاد بتنسيق لوحة 96 بئرا أو 384 بئرا مناسبة لتحليل الفحص باستخدام تقنيات التصوير مع أصباغ الخلايا والأجسام المضادة ، جنبا إلى جنب مع فحوصات نمو الخلايا العصبية. تظهر الخلايا تعبيرا عن علامات نوع الخلايا العصبية ونمو الإسقاطات العصبية والنجمية في غضون 7 أيام من الثقافة. وبالتالي ، سيقدم هذا البروتوكول منهجية لتطوير نموذج زراعة عصبية 3D عالي الإنتاجية للاستخدام في تطبيقات اكتشاف الأدوية.
الشكل 1: نظرة عامة توضيحية على المنهجية المستخدمة في الثقافات المشتركة للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد. يتم دمج الخلايا العصبية والخلايا النجمية البشرية المشتقة من iPSC مع محاليل المنشط والحبر الحيوي التي تحتوي على الببتيدات النشطة بيولوجيا ويتم طباعتها بيولوجيا على سقالات هيدروجيل بتنسيقات 96 بئرا أو 384 بئرا باستخدام تقنية الطباعة الحيوية عند الطلب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لم تكن الحاجة إلى نماذج دقيقة للجهاز العصبي المركزي أعلى من أي وقت مضى ، وقد دفعت قيود نماذج زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) جيلا من نماذج الجهاز العصبي المركزي المعقدة في السنوات الأخيرة19. ومع ذلك ، فإن العديد من نماذج 3D المعقدة التي تمثل التفاعلات بين أنواع الخلايا العصبية و ECM لها قيود من شأنها أن تمنع تطبيق هذه النماذج في العمليات الصناعية6،20،21. في هذا البروتوكول ، نقوم بتطوير نموذج زراعة مشتركة ثلاثي الأبعاد للخلايا العصبية والخلايا النجمية البشرية المشتقة من iPSC ، والذي يهدف إلى حل بعض هذه القيود باستخدام تقنية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد لإنشاء سقالة هيدروجيل نشطة بيولوجيا بتنسيقات 96 بئرا و 384 بئرا.
تم تبسيط منهجية تطوير هذه النماذج من خلال برنامج تصميم خرائط اللوحات ، وبروتوكولات الطباعة التي تم إنشاؤها تلقائيا ، وعملية الطباعة الموجهة من الطابعة الحيوية. ومع ذلك ، نظرا للطبيعة الحساسة لأنواع الخلايا الحساسة المشتقة من iPSC المستخدمة في هذا البروتوكول ، يجب توخي الحذر من خلال الخطوات الحاسمة التالية في الذوبان والثقافة. أولا ، إن إدراج مثبط ROCK (ROCKi) له فوائد عديدة طوال عملية الطباعة الحيوية وأثناء الزراعة المبكرة. ذوبان الخلايا هو نقطة حرجة يمكن أن تواجه فيها الخلايا العصبية استجابة إجهاد ، ويمكن أن تقلل بروتوكولات الذوبان غير الصحيحة من فرص البقاء على قيد الحياة22. يوصى عادة بإذابة الخلايا وإضافة الوسائط ورفع الخلايا إلى درجة حرارة الحاضنة بأكبر قدر ممكنمن الكفاءة 23. ومع ذلك ، أثناء عملية الطباعة الحيوية الموصوفة في هذا البروتوكول ، من الضروري إعادة تعليق الخلايا العصبية والخلايا النجمية في محلول منشط بدلا من الوسائط ، ولن يتم رفع الخلايا فوق درجة حرارة الغرفة حتى نهاية تشغيل الطباعة (حتى 30 دقيقة بعد الذوبان). وبالتالي ، فإن إضافة ROCKi إلى الوسائط مباشرة بعد الذوبان وتضمين ذلك خلال خطوتي الطرد المركزي (الخطوات 2.1–2.7 و 1.3.15-1.3.20) أمر حتمي لتثبيط مسارات إجهاد الخلايا ، مما قد يؤدي إلى انخفاض مستويات الصلاحية24. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن ROCKi يعزز نمو الخلايا العصبية ويحسن نضج الخلايا العصبية25. وبالتالي ، تستمر مكملات ROCKi لمدة 48 ساعة بعد الطباعة الحيوية. ومع ذلك ، من الضروري إزالة مكملات ROCKi بعد 48 ساعة لضمان الغسيل الكامل أثناء تغييرات الوسائط اللاحقة قبل استخدام الخلايا للفحص.
هناك خطوة أخرى تتطلب اهتماما نقديا وهي أثناء إضافة الوسائط بعد الطباعة وتغييرات الوسائط (الخطوات 2.8-2.13). تتميز سقالة الهيدروجيل المطبوعة بيولوجيا بصلابة ميكانيكية حيوية مكافئة تبلغ 1.1 كيلو باسكال فقط ، أي ما يعادل المادة الرمادية. كما هو موضح في الخطوة 2.10 ، من الأهمية بمكان أن يتم وضع الماصة برفق في جانب البئر أثناء إضافة الوسائط والشفط لمنع الاضطراب. هذا له أهمية خاصة لألواح 384 بئرا ، حيث يشغل مستوى الهلام نسبة أعلى من إجمالي حجم البئر. يجب أيضا استخدام هذه الطريقة في آبار التحكم 2D لمنع رفع حواف الخلايا وقص النواتج العصبية. يود المؤلفون أيضا تسليط الضوء على أهمية التقنية المعقمة داخل الطابعة الحيوية ، والتي يجب التعامل معها بحذر مماثل لتلك الخاصة بخزانة السلامة البيولوجية المستخدمة في مزارع الخلايا المشتقة من iPSC. يتضمن ذلك الترشيح المعقم بنسبة 70٪ EtOH و dH2O المستخدمة في إجراءات الإضاءة الخضراء والطباعة ، والحفاظ على الأغطية على الخراطيش والألواح أثناء تحريك اليدين داخل وخارج الطابعة الحيوية ، وإزالة التلوث من الأسطح داخل الطابعة الحيوية باستخدام مناديل الإيثانول بنسبة 70٪ قبل الطباعة وبعدها.
يتم اختيار سقالة الهيدروجيل المطبوعة بيولوجيا ، المكونة من الحبر الحيوي وحلول المنشط ، والتي تم اختيارها لتطوير هذا النموذج من مجموعة من الأحبار الحيوية وحلول المنشطات التي طورتها Inventia Life Science لاستخدامها في طابعة RASTRUM الحيوية. تم تحديد Laminin وحمض الهيالورونيك كجزيئات ذات صلة بالنضج العصبي المشتق من iPSC نظرا لدورهما في التوجيه المحوري ، وتشكيل المشبك العصبي ، وتشكيل الشبكة المحيطة بالخلايا العصبية26,27. علاوة على ذلك ، تم اختيار صلابة ميكانيكية حيوية تبلغ 1.1 كيلو باسكال ، حيث ثبت أن الهلاميات المائية منخفضة الكثافة تمكن من نمو الخلايا العصبية بشكل أفضل من الخلايا العصبية12. إذا تم إجراء تعديلات على البروتوكول باستخدام الخلايا العصبية والخلايا النجمية التي تم تمييزها داخليا أو من مورد تجاري مختلف ، فمن المستحسن إجراء اختبار اختيار المصفوفة لتحديد سقالة هيدروجيلالأكثر دعما 15. علاوة على ذلك ، قد تحتاج أيضا إلى تحسين كثافة الخلايا إذا تم إجراء تغييرات على مصادر الخلايا لضمان الجدوى المثلى ومنع اكتظاظ الهيدروجيل. بالنسبة لجميع التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها المتعلقة بوظيفة bioprinter ، يوصي المؤلفون بالاتصال بالمصنعين والرجوع إلى بروتوكولات الشركة المصنعة.
يحتوي الجهاز العصبي المركزي على مجموعة واسعة من الأنواع الفرعية العصبية والخلايا الدبقية ، وكلها موجودة في منافذ دماغية مختلفة ولها أدوار محددة تساهم في الوظيفة العصبية28. في سياق هذا النطاق الواسع ، يمثل هذا النموذج فقط نوعين من الخلايا الأكثر وفرة (الخلايا النجمية والخلايا العصبية الجلوتاماتية المثيرة). يتم حذف أنواع الخلايا المهمة مثل الخلايا الدبقية الصغيرة ، oligodendrocytes ، والخلايا البطانية المكونة للحاجز الدموي الدماغي من هذا النظام. يمكن أن يكون إدراج الخلايا الدبقية الصغيرة ذا أهمية في التركيز على تفاعلات المناعة العصبية ، ويمكن أن تكون الخلايا قليلة التغصن ذات أهمية في الأمراض التي تؤثر على الميالين المركزي. بالإضافة إلى دورها في علم الأمراض ، تفرز خلايا مثل الخلايا البطانية المكونة للحاجز الدموي الدماغي إنزيمات استقلاب الدواء ، مما قد يؤثر على استخدام هذا النموذج لفحوصات الحرائك الدوائية29. قد يكون هناك قيد آخر للنموذج هو نسبة الخلايا النجمية إلى الخلايا العصبية. تختلف نسبة الخلايا النجمية إلى الخلايا العصبية اختلافا كبيرا بين مناطق الدماغ ، مع قيم مقترحة تتراوح بين 1: 1 و 1: 330,31. يحتوي هذا النموذج على نسبة تقريبية من الخلايا النجمية 1: 1.5 إلى الخلايا العصبية. وبالتالي ، قد لا يكون هذا النموذج ذا صلة بنمذجة مناطق الدماغ حيث تكون الخلايا النجمية أكثر وفرة ، كما هو الحال في مناطق المادة البيضاء30.
تم نشر بروتوكولات أخرى لتطوير نماذج 3D للزراعة المشتركة المطبوعة بيولوجيا في السنوات الأخيرة. قدم منشور صادر عن Sullivan et al. ، 2021 ، نموذجا عصبيا مطبوعا بيولوجيا ثلاثي الأبعاد باستخدام الخلايا السلفية العصبية المشتقة من iPSC ، مما يدل على قابلية عالية للبقاء بعد الطباعة وتعزيز وظيفة الخلايا العصبية مقارنة بالثقافات ثنائية الأبعاد32. ومع ذلك ، في هذا البروتوكول ، تم استخدام الخلايا السلفية العصبية كمصدر للخلايا وتم الحفاظ عليها في الثقافة لمدة 4 أسابيع. في هذا البروتوكول ، تم استخدام الخلايا العصبية والخلايا النجمية المشتقة من iPSC المتاحة تجاريا. وهذا يسمح بإنشاء شبكة 3D من الخلايا المستزرعة المشتركة في أقل من 7 أيام. كما يتضح من تحليل نمو الخلايا العصبية ، يبدأ نمو الخلايا العصبية في غضون 24 ساعة ويستمر بطريقة خطية طوال فترة 156 ساعة التي تمت مراقبة نمو الخلايا فيها. يمكن أن يعزى الإنشاء السريع لهذه الشبكات جزئيا إلى استخدام الخلايا العصبية glutamatergic التي تستخدم التعبير الجيني المحسن المحرض بالدوكسيسيكلين ل NGN2 ، والذي يظهر تعبيرا عن علامات النوع الفرعي العصبية الناضجة في غضون 7 أيام ، حتى في ثقافة 2D33. يعد تقصير فترة النمو هذه باستخدام هذه التقنية أمرا مهما لتنفيذ النماذج في صناعة المستحضرات الصيدلانية الحيوية ، حيث يتطلب تطوير الفحص تحولا سريعا وتطوير نماذج الخلايا15.
في الختام ، يظهر هذا النموذج إمكانية وجود نموذج 3D للخلايا العصبية والخلايا النجمية ، والذي يتم إنشاؤه بسرعة وسهولة لأغراض الفحص. يمكن أن تكون التطبيقات المستقبلية لهذا النوع من النماذج لجهود اكتشاف الأدوية عبر أمراض الجهاز العصبي المركزي المختلفة ، مع فرصة للتوسع في أمراض مختلفة باستخدام خطوط iPSC للمريض أو المرض المحرر جينيا. علاوة على ذلك ، فإن استخدام تعبير NGN2 المستحث بالدوكسيسيكلين iPSC المشتق من الخلايا العصبية glutamatergic يسمح للخلايا بالوصول إلى مرحلة النضج في وقت أقل ، والذي يمكن استخدامه لتطوير نماذج لشيخوخة الدماغ لأبحاث التنكس العصبي. يمكن أيضا توسيع هذا النظام من خلال استخدام أنواع إضافية من الخلايا في الزراعة المشتركة ، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا قليلة التغصن.
The authors have nothing to disclose.
يود المؤلفون أن يشكروا أليكس فولكيرلينج ومارتن إنجل وراشيل بليتش على مساعدتهم في تطوير البروتوكول وتعليقاتهم على المخطوطة.
2-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350010 | |
384-well plate | PerkinElmer | 6057300 | |
96-well plate | PerkinElmer | 6055300 | |
Activator fluid F299 | Inventia Life Science | N/A | |
Activator fluid F3 | Inventia Life Science | N/A | |
B27 (50x) minus Vit A | Thermofisher | 12587010 | |
Bioink fluid F261 | Inventia Life Science | N/A | |
Bioink fluid F32 | Inventia Life Science | N/A | |
Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D5207 | |
GlutaMAX (100x) | Thermofisher | 35050061 | |
Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150115 | |
Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
Hoechst | Abcam | ab228551 | |
Human BDNF Recombinant Protein | Thermofisher | PHC7074 | |
Human NT3 Recombinant Protein | Thermofisher | PHC7036 | |
iCell Astrocytes | Fujifilm CDI | 1434 | |
INCell Analyser 6500HS | Molecular Devices | N/A | high content imaging system |
Incucyte S3 | Sartorius | N/A | |
ioGlutamatergic Neurons (Large vial) | Bit.bio | e001 | |
Laminin (1 mg/mL) | Sigma Aldrich | L2020 | |
Live/dead kit (Calcein-AM, Ethidium homo-dimer-1) | Invitrogen | L3224 | |
Mouse anti-BIII tubulin NL637 conjugated | R&D systems | SC024 | |
Neurobasal media | Thermofisher | 21103049 | |
Normal Donkey Serum | Abcam | ab7475 | |
NucBlue Live (Hoechst 33342) | Thermofisher | R37605 | |
Opti-MEM | Thermofisher | 11058021 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
PEI 50% in H2O | Sigma Aldrich | 181978 | |
Pierce Borate Buffer 20x | Thermofisher | 28341 | |
Prism | GraphPad | Data analysis software | |
Rabbit anti-ionotropic glutamatre receptor 2 (GluR2) | Abcam | ab206293 | |
RASTRUM(TM) Bioprinter | Inventia Life Science | N/A | Bioprinter |
RASTRUM(TM) Bioprinter Cartridges | Inventia Life Science | N/A | Bioprinter Cartridges |
RASTRUM(TM) Targeting plate | Inventia Life Science | N/A | Targeting plate |
Rho kinase (ROCK) inhibitor | Abcam | ab120129 | |
Sheep anti-GFAP NL493 conjugated | R&D systems | SC024 | |
Signals Image Artist | PerkinElmer | N/A | Image analysis platform |
Triton X-100 | Thermofisher | HFH10 | |
Zeiss Axio Observer | Zeiss | N/A | Inverted microscope platform |