2次元(2D)単一培養から3次元(3D)多文化まで、さまざまな用途に対応するスキンモデルの構築

この研究は、ヘルシンキ宣言のガイドラインに従って実施され、ワルシャワ医科大学の倫理委員会 (KB/7/2022) によって承認されました。インフォームドコンセントは、研究に関与するすべての被験者から得られました。 注:高度な皮膚モデル調製物に記載されている手順は、市販の初代皮膚細胞および細胞株のいずれかを使用して、または患者から単離された初代細胞を用いて実施することができる。市販のセルには関連文書が付属しており、ほとんどの国での研究での使用には追加の承認は必要ありません。ただし、一部の国では義務であるため、地方倫理委員会の規則で確認する必要があります。患者から単離された初代細胞を研究に使用する必要がある場合、まず、研究は地元の倫理委員会によって承認されなければならず、それは彼らの厳格なガイドラインに従って実施される必要があります。さらに、書面によるインフォームドコンセントは、すべての皮膚組織ドナーから収集する必要があります。初代皮膚細胞の単離は本稿の主題ではなかったが、例示的な単離手順は、Kostenら(ケラチノサイト)18、Ścieżyńskaら(メラノサイト)19、Krögerら(線維芽細胞および肥満細胞)20に見出すことができる。正常な皮膚細胞と細胞株のほとんどは、BSL1クラスの安全性レベルを持っています。彼らは脅威を引き起こさない。ただし、使用される実験装置は、制御された条件下での動物およびヒトの細胞培養の基準を満たす必要があります。 1. 皮膚細胞培養 注:皮膚細胞の培養は、接着細胞または浮遊細胞専用のフラスコ(細胞の種類によって異なります)で、インキュベーター内で37°C、二酸化炭素含有量5%で実施する必要があります。それらの栽培および研究のための使用に関連する活動は、無菌状態を必要とし、紫外線C(UVC)に15〜30分間さらされた後、層流チャンバーで行わなければなりません。細胞懸濁液を採取し、それを用いて二次元モデルおよび三次元モデルを作成するには、細胞の種類に応じた手順を実施する必要があります(ケラチノサイト、線維芽細胞、メラノサイトなどの接着細胞の場合はステップ1.1、肥満細胞の非接着細胞の場合はステップ1.2)(図3)。異なる培養フラスコサイズについて、記載されている方法で使用したすべての試薬(培地、リン酸緩衝生理食塩水、トリプシン溶液など)の容量を 表3に示します。細胞の種類(試薬の濃度と組成、遠心分離方法など)に依存するパラメータを 表4に示します。播種に用いた細胞密度を 表5に示します。これらの表はすべて、このセクションの最後にあります。 図3:接着細胞培養と非接着細胞培養。 接着細胞培養と非接着細胞培養の一般的なステップバイステップの手順(番号はステップ1.1および1.2の説明に対応しています)。図はMS PowerPointで作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 接着細胞の懸濁液を得る培養フラスコから培地を取り出します。 リン酸緩衝生理食塩水で細胞を穏やかに洗浄します(PBS、 表3)。 エチレンジアミンテトラ酢酸にトリプシン溶液を添加します(トリプシン-EDTA溶液、 表3)。フラスコを37°Cでインキュベートし、光学顕微鏡で表面からの細胞の剥離を制御します。 分離した細胞を少なくとも2倍の全増殖培地またはトリプシン中和剤に懸濁して、トリプシン(2:1)を不活性化します(容量については表3を、試薬については 表4を参照してください)。フラスコの内容物を15mLチューブに定量的に移します。 少量(20 μL)の細胞懸濁液を1.5 mLチューブに取り、手動または自動の血球計算盤で細胞をカウントします。 チューブを遠心分離し( 表4のパラメータ)、上清の大部分を取り除き、細胞ペレットを残りの液体の少量に再懸濁します。次に、細胞密度が新しい培地の必要量を播種または再計算するのに適切な場合は、遠心分離前の容量( 表3の容量)を得るのに十分な新鮮な培地を追加します。注:メラノサイトなどの一部の細胞は遠心分離に非常に敏感であるため、短時間の距離で再度遠心分離する必要がなくなります。 実験(皮膚細胞の2D/3D単培養または多培養)に必要な密度(細胞/mL、 表5の細胞密度)の細胞懸濁液を調製します。注:細胞をさらに培養する場合は、5,000〜8,000細胞/ mLを新しいフラスコに戻し、新しい培地( 表3の容量)を追加します。 非接着性細胞の懸濁液を得る細胞懸濁液を入れた培地を培養フラスコから取り出し、15 mLチューブに定量的に移します。 少量(20 μL)の細胞懸濁液を新しい1.5 mLチューブに取ります。手動または自動の血球計算盤で細胞をカウントします。 チューブを遠心分離し( 表4のパラメータ)、上清の大部分を取り除き、細胞を残りの液体の少量に再懸濁します。次に、新しい培地の必要量を播種または再計算するのに細胞密度が適切である場合は、新鮮な培地を添加して予備遠心分離容量( 表3を参照)を得ます。 実験(皮膚細胞の2D/3D単培養または多培養)に必要な密度( 表5で提案されているように、mLあたりの細胞数)の細胞懸濁液を調製します。注:細胞をさらに培養する場合は、5,000〜8,000細胞/ mLを新しいフラスコに戻し、新しい培地を追加します。      25 cm2 カルチャーフラスコ 75 cm2 カルチャーフラスコ 培地 [mL] 4–5 8–12 PBS樹脂 [mL] 5 10 トリプシン-EDTA [mL] 0.5–1 1–2 中和媒体 [mL] 1–2 2–4 表3:細胞懸濁液の培養および調製中に使用される試薬の量。 皮膚細胞の単一培養 トリプシン トリプシン不活性化剤 遠心分離 2Dモノカルチャー用のミディアムタイプ ケラチノサイト 0.25% トリプシン中和剤付き 300 x g、5分、室温 ケラチノサイト増殖培地2 線維芽細胞 0.25% ミディアム付き 300 x g、5分、室温 DMEM、10S メラノサイト 0.025% トリプシン中和剤付き 300 x g、3分、室温 Medium 254、PMAフリーヒトメラノサイト成長サプリメント-2 肥満細胞 必須ではありません 必須ではありません 300 x g、3分、室温 IMDM、10% FBS、1% 非必須アミノ酸、226 μM α-モノチオグリセロール 表4:トリプシン処理、遠心分離パラメータ、および培地の種類は、細胞の種類によって異なります。 モデルタイプ 細胞密度 [cell/mL] 2Dの 単層 線維芽細胞 2 x 105 肥満細胞 ケラチノサイト メラノサイト 3D(3D) スフィア(吊り下げ式) 線維芽細胞 5×105 肥満細胞 ケラチノサイト メラノサイト セルの混合 スフィア(リミッティングセル接着法) 線維芽細胞 2 x 105 肥満細胞 ケラチノサイト メラノサイト セルの混合 同等 線維芽細胞 1 x 105 肥満細胞 1 x 104 ケラチノサイト 8×105 メラノサイト 5×104 表5:さまざまなタイプの皮膚モデルの細胞播種密度。 2. 皮膚細胞球の調製 注:球体を作成するために、ハンギングドロップ法の使用はステップ2.1(図4)で説明され、細胞接着の制限に焦点を当てたアプローチはステップ2.2(図5)に示されています。それにもかかわらず、球体は非常に小さく、不安定である可能性があるため、これらの方法で実行される活動には、忍耐力、繊細さ、そしてゆっくりとした行動が必要です。 吊り下げ式適切な細胞密度を使用して、目的の球サイズを達成します(推奨細胞密度5 x 105 細胞/mL、 表5)。 細胞懸濁液20 μLをペトリ皿またはマルチウェルプレートの蓋にピペットで移します(図4A)。 皿/プレートを底の部分で覆い、そっと裏返します(ぶら下がっている滴が蓋に自動的に作成されます、 図4B)。 プレートのペトリ皿/ウェルに滅菌水/ PBS溶液を入れて、液滴による培地の蒸発を防ぎます。 液滴を37°Cで48〜72時間インキュベートします。注:重力によって細胞が引き下げられ、アクセス可能な表面がないため、細胞が血管に付着するのを防ぎ、細胞凝集を促進します。ただし、一部の細胞タイプでは、より長いインキュベーションが必要になる場合があります。 次のステップを実行する前に、新しいプレートのウェルを満たします(または、ウェルから水/ PBSを取り除いた古いプレートを使用)完全な増殖培地(100μL)を入れます。注:次のステップとして、200μLのチップを取り、各チップエンドの1/5を取り外し、使用前に滅菌してください。 細胞球をマルチウェルプレートのウェルに移し、カットエンド付きの滅菌ピペットチップを使用します。200 μLのチップを取り、各チップエンドの1/5を取り外し、使用前に滅菌してください(図4C)。注意: この手順は、皿/プレートの反転中の液体の流れが球体を損傷する可能性があるため、難しい場合があります。 移した球体をマルチウェルプレートで37°Cの1日間インキュベートしてから、さらなる実験(化合物の添加、細胞毒性アッセイ、等価物への球体導入など)を行います(図4D)。 細胞接着を制限する方法細胞播種の前に、U底プレートのウェルを界面活性剤溶液(例えば、プルロニックF−127、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール)で覆う21。PBS中の1%界面活性剤溶液100 μLを調製し、各ウェルに加えます。プレートを溶液と共溶かして37°Cで24時間インキュベートします(図5A-C)。必要に応じてプレートを長く保管しますが、PBSバッファーを追加することで液面を維持します。 ウェルあたり50 μLで、所望の細胞密度で細胞懸濁液を調製します(2 x 105/mLを播種する際の推奨細胞密度、 表5)。 細胞を播種する前に、ウェルから界面活性剤溶液を取り出して、溶解による細胞膜の破壊を回避します(図5D)。 細胞溶液をプレートに加え、37°Cで24時間インキュベートして細胞凝集体に到達させます(図5E)。約1〜3日後、球体が形成され(図5F)、さらなる実験に使用できるようになります。 図4:吊り下げ式 (A)セル懸濁液を蓋にピペッティングし、蓋を皿の底部で覆います。(B)皿を回転させて吊り下げる液滴を作成する。(C)皿の底部に水/ PBSを追加する(液体の蒸発を制限する)。(D)細胞球を作成するための吊り下げ滴による皿のインキュベーション。(E)形成された球体を有する液滴の収集およびマルチウェルプレート中の転写球体の安定化。フィギュアは Biorender.com で作成しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図5:制限細胞接着法による球体の段階的な調製(A)U底ウェル;(b,c)界面活性剤溶液による細胞接着の制限;(D)井戸から溶液を除去する。(e)播種細胞;(F)細胞の凝集と球の形成。フィギュアは Biorender.com で作成しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 3. 全層皮膚当量物の調製 注:全層(表皮および真皮)皮膚同等物の発達は、3つのステップに分けることができます（図6）典型的な真皮細胞(線維芽細胞および肥満細胞など、 図6A)の発生を伴う人工真皮層の調製、人工表皮に含まれる細胞(主にケラチノサイトおよびメラノサイト、 図6B)に含まれる細胞の播種)および角質化プロセスの可能性を伴うケラチノサイトの垂直成長(角質層の形成、 図6C)。全層皮膚当物の調製は、ステップ3.1(3.1.1-3.1.10)に記載されている。それほど進化していない皮膚同等物が必要な場合(例えば、表皮型のみ)、選択した細胞型(ケラチノサイトなど)を市販のコラーゲンまたはポリカーボネート膜に直接播種し、角質化プロセスを誘導する可能性のある培養も行うことができます(ステップ3.1.9-3.1.10に直接進んでください)。 図6:インサートにおける全層皮膚同等物の段階的調製 (A)真皮細胞による偽真皮層の調製、(B)表皮細胞の播種、(C)培地での同等物のさらなる培養、(D)空気液界面培養は、層状上皮の形成を促進する。フィギュアは Biorender.com で作成しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 24ウェルプレートにおける全層皮膚当量物の調製水、PBS(10倍)、1 M NaOH、I型コラーゲン溶液を入れたチューブを氷の上に置きます。 ハイドロゲルに播種する真皮細胞(線維芽細胞や肥満細胞など、10:1の比率)の適切な数を決定します。適切な数の真皮細胞を1.5 mLチューブ( 表5の細胞密度に応じて、500 μLの線維芽細胞と500 μLの肥満細胞)に移し、細胞を遠心分離します(300 x g、3分間、RT)。 上清を取り除き、695 μLの水/100 μLのPBS(10x)/5 μLのNaOHの混合物に細胞を穏やかに再懸濁します。注:全溶液1 mLが十分でない場合は、 表6 を使用して各試薬の容量を再計算してください。 混合物に200μLのコラーゲン溶液を加え、ピペッティングで穏やかに混合します。注:混合物の一貫性が密集するため、注意してください。 調製した混合物200μLを24ウェルプレートのインサートに加えます。角質層のないモデルの場合は、 24ウェルプレートの各ウェルに500μLを添加します。 プレートを室温(RT)で10分間インキュベートした後、インキュベーターに30分間移します。注:他のアクションの前に、ヒドロゲルが重合したかどうかを確認してください。 ハイドロゲルの表面に細胞を播種する前に、PBSバッファー(500 μL/well)ですすいでください。 ハイドロゲルの上に播種する表皮細胞(ケラチノサイトやメラノサイトなど、15:1の比率)の適切な数を決定します。10% FBSを添加したDMEM培地500 μLに細胞混合物を調製し(ケラチノサイト250 μLとメラノサイト250 μLを添加し、細胞密度は 表4に記載)、ウェルに穏やかに加えます。注:場合によっては、最初にメラノサイトを播種し、それらがハイドロゲル上によく広がるのを許し、さらに24時間後に培地を取り除き、ケラチノサイトを播種する方が良い場合があります。その場合は、250 μLの細胞懸濁液と250 μLの培地を加えます。 細胞増殖の速度に応じて、プレートを37°Cで2〜5日間インキュベートし、48時間ごとに培地交換(FBSの濃度が10%から1%に減少)を行い、光学顕微鏡で細胞モニタリングを行います。 ヒドロゲルの上にケラチノサイトの単層を取得した後に角質化プロセスを誘導する場合は、カルシウムイオンとL-アスコルビン酸を追加で2〜7週間(1.5μM CaCl2 および50μg/mL L-アスコルビン酸の濃度)追加で補充したFBSフリー培地を使用します。注:インキュベーションの時間は、使用するケラチノサイトとその分化速度によって異なります。 試薬 試薬の体積を計算するための方程式 計算例 (最終容量 = V合計 1 mL の場合) I型コラーゲン溶液 (Cコラーゲン =10mg/mL) 0.2 mL = 200 μL PBSの(10倍) 0.1 mL = 100 μL 1 M NaOH 0.005 mL = 5 μL 滅菌 H2O 0.695 mL = 695 μL 表6:2 mg/mLコラーゲンI型ハイドロゲル調製に必要な試薬量の計算。 4. 細胞染色法による3次元皮膚モデルにおける細胞種の同定 注:開発された皮膚モデルが予想される細胞で構成されていることを確認するには、細胞染色を行うのが良いでしょう。これは、特定のモデル22でターゲット実験を行う前に重要なステップです。3D皮膚モデルの場合、細胞染色の前に、パラフィンに所定のモデルを埋め込み、人工組織をミクロトーム上に切断した顕微鏡スライドを作製する必要があります(ステップ4.1)。 図7:3Dスキンモデルの埋め込み、細胞染色、顕微鏡観察の基本ステップ。 フィギュアは Biorender.com で作成しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 3Dスキンモデルの埋め込み皮膚相当物をPBSで5分間RTで2回洗浄し、PBS中の3.7%パラホルムアルデヒド溶液を使用して固定します(30分、RT)。PBSで洗浄手順を繰り返します。 包埋する前に、エタノール溶液の濃度を上げることでインキュベートすることにより、皮膚相当物を脱水します:50%(15分)、70%(15分)、96%(2回、30分)、および99.8%(2回、30分)。 固定および脱水皮膚相当物をパラフィンで満たされた型に入れます。注意: 同等のものを適切な向きに置きます。 型をカセットで覆い、その上にパラフィンを追加します。RTで最大30分間固化させます。 パラフィン包埋皮膚相当物を-80°Cで少なくとも1時間凍結します。 ミクロトームの電源を入れ、パラフィン包埋皮膚当量を挿入し、5μm切片を切開します。切断した人工組織スライスを顕微鏡スライドに置き、37°Cで少なくとも8時間乾燥させます。 スライドをキシレンに浸し(2回、10分)、次に、減少するエタノール濃度99.8%(5分)、96%(5分)、70%(5分)、および50%(5分)でスライドを再水和します。 スライドをエタノール溶液から取り出し、水で2回(5分間)すすぎます。注:従来の細胞染色は、特定の色素(ヘマトキシリン、エオシン23)を適用するか、バイオマーカーを選択的に標的とする抗体(線維芽細胞のコラーゲン1A2、ケラチノサイトのサイトケラチン14、メラノサイト24のメランAまたはチロシナーゼを含む)を使用して行われます。定期的なヘマトキシリンおよびエオシン染色は、さまざまな企業が作成したプロトコルに従うことで行うことができます(ステップ4.2)。一方、免疫蛍光染色または免疫組織化学染色が必要な場合、手順は異なり、大幅に長くなります(ステップ4.3および4.4)。非特異的な反応を避けるためには、異なる動物種で産生された一次抗体を使用し、次に専用の二次抗体を使用します。 3D皮膚モデルのヘマトキシリンおよびエオシン染色顕微鏡スライドをヘマトキシリン溶液中でRTで3分間染色します。 スライドを酸性アルコール溶液で1分間洗浄します。注:2 mLの35%〜38%塩酸と98 mLの99.8%エチルアルコールを混合して、酸性アルコール溶液を調製します。 次に、スライドを0.1%重炭酸ナトリウム溶液で洗浄して、目に見える繊細な青紫色にします。注:0.1%重炭酸ナトリウム溶液を得るには、100 mgの重炭酸ナトリウムを100 mLの超純水に溶解します。. スライドを95%エタノールで1分間洗浄します。 顕微鏡スライドをエオシン溶液中でRTで1分間染色します。 スライドを95%エタノールで1分間、99.8%エタノールで2分間洗浄します。 スライドをキシレンで2分間ずつ2回洗います。 バルサムをマウントし、スライドの上部にカバースリップを置きます。サンプルは顕微鏡観察の準備ができています。 3D皮膚モデルの免疫蛍光染色スライドをPBSですすいでください(5分)。 ブロッキング溶液(3%ウシ血清アルブミン[BSA]またはPBSバッファー中の無脂肪乳に0.1% Triton X-100および0.1% Tween 20を添加)を調製し、スライドを室温で1時間インキュベートします。 スライドをPBSバッファーで2回洗浄します(5分)。 一次抗体をPBSバッファーで希釈し(生産者の推奨、 表7)、スライドを室温で1〜2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。 スライドをPBSバッファーで2回洗浄します(5分)。 二次抗体をPBSバッファーで希釈し(生産者の推奨、 表7による)、スライドを室温で1時間インキュベートします。 スライドをPBSで2回洗います(5分)。 核染色用の色素溶液(Hoechst 33342またはDAPI、 表7など)を調製し、スライドを室温で最大15分間インキュベートします。 スライドをPBSで洗浄します(5分)。 バルサムに封入し、切片をカバーガラスで覆い、蛍光顕微鏡を用いて細胞染色の影響を可視化します。 3D皮膚モデルの免疫組織化学染色手順4.3.1〜4.3.5を実行します。 さらに、二次抗体が結合する酵素に適したバッファーで洗浄ステップを実行します。 二次抗体を標識酵素に適したバッファーで希釈し(生産者の推奨による)、スライドを室温で1時間インキュベートします。 スライドをPBSで2回洗います(5分)。 使用した酵素に適した基質の溶液を調製し、生産者の推奨に従ってスライドをインキュベートします。 スライドをバッファーで洗浄し(5分)、バルサムにマウントします。 明視野顕微鏡を用いて細胞染色の影響を可視化します。 細胞タイプ/細胞オルガノイドが検出されました 染色剤 ディリューション/集中力 肥満細胞 アビジン-スルフォロダミン101 1 μg/mL 線維芽細胞 ウサギで産生されたCol1A2抗体 1:50 FITCと結合したヤギ抗ウサギ二次抗体 1:250 ケラチノサイト マウスで産生されたサイトケラチン14抗体 1:50 FITCと結合したヤギ抗マウス二次抗体 1:250 メラノサイト マウスで産生されたMelan-A抗体 1:50 FITCと結合したヤギ抗マウス二次抗体 1:250 核 ヘキスト33342 1 μg/mL ダピ 1 μg/mL 表7:細胞染色に使用した試薬の濃度と希釈率。