İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin Kriyoprezervasyonu ve Biyoenerjetik Değerlendirmesi
Summary
İzole edilmiş periferik kan mononükleer hücreleri, bağışıklık fonksiyonlarının ve bozukluklarının, metabolik hastalıkların veya mitokondriyal fonksiyonların analizi için kullanılabilir. Bu çalışmada, PBMC’lerin tam kandan hazırlanması ve ardından kriyoprezervasyon için standartlaştırılmış bir yöntem tanımlanmıştır. Kriyoprezervasyon bu zaman ve mekandan bağımsız hale getirir.
Abstract
Ökaryotik hücrelerin fizyolojik işlevleri, esas olarak mitokondri tarafından sağlanan enerjiye dayanır. Mitokondriyal disfonksiyon, metabolik hastalıklar ve yaşlanma ile bağlantılıdır. Oksidatif fosforilasyon, enerjik homeostazın korunması için çok önemli olduğu için belirleyici bir rol oynar. PBMC’ler, mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için minimal invaziv bir örnek olarak tanımlanmıştır ve hastalık koşullarını yansıttığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, mitokondriyal biyoenerjetik fonksiyonun ölçümü, insan örneklerinde çeşitli faktörlerle sınırlandırılabilir. Sınırlamalar, alınan numune miktarı, genellikle birkaç güne yayılan numune alma süresi ve konumlardır. Toplanan numunelerin dondurularak saklanması, numunelerin tutarlı bir şekilde toplanmasını ve ölçülmesini sağlayabilir. Ölçülen parametrelerin dondurularak saklanmış ve taze hazırlanmış hücreler arasında karşılaştırılabilir olmasına dikkat edilmelidir. Burada, bu hücrelerdeki mitokondrinin biyoenerjetik işlevini analiz etmek için insan kan örneklerinden PBMC’leri izole etme ve dondurarak saklama yöntemlerini açıklıyoruz. Burada açıklanan protokole göre dondurularak saklanan PBMC, yeni hasat edilmiş hücrelere kıyasla hücre sayısı ve canlılığı, adenozin trifosfat seviyeleri ve ölçülen solunum zinciri aktivitesinde yalnızca küçük farklılıklar gösterir. Tarif edilen preparatlar için sadece 8-24 mL insan kanına ihtiyaç vardır, bu da klinik çalışmalar sırasında numunelerin çok merkezli olarak toplanmasını ve biyoenerjetik değerlerinin yerinde belirlenmesini mümkün kılar.
Introduction
İnsan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC’ler), yaşlanma süreçleri veya dejeneratif hastalıklarla ilgili olanlar gibi immünolojik ve biyoenerjetik konuların incelenmesi de dahil olmak üzere birçok bilimsel alanda çeşitli uygulamalar için kullanılmaktadır 1,2. PBMC’ler bileşim olarak heterojendir ve lenfositler (B hücreleri, T hücreleri ve NK hücreleri), monositler ve dendritik hücrelerden oluşur. Hücreler bazen bir denek içinde büyük bireysel farklılıklar ve farklılıklar gösterir, bu nedenle bu hücreleri işlemek için standartlaştırılmış prosedürler gereklidir. İzolasyonun canlılığı ve saflığı gibi önemli parametreler, kullanımı için temel gerekliliklerdir ve ayrıca toplama zamanı, melatonin seviyesi, deneğin aç olup olmadığı ve diğerleri gibi çevresel faktörlerden etkilenir 3,4.
PBMC’lerin biyoenerjetik üzerine yapılan çalışmalara dayanarak, burada PBMC’lerin izolasyonu, kriyoprezervasyonu ve yetiştirilmesi için diğer yöntemler için de uygun olan bir yöntem açıklıyoruz. Kas biyopsisi mitokondriyal enerji metabolizmasıiçin altın standart olarak kabul edilirken5, kan hücrelerinin incelenmesi hızlı, minimal invaziv bir prosedürdür. Buna ek olarak, giderek daha fazla çalışma, yaşlanma ve Alzheimer hastalığında (AD) mitokondriyal fonksiyondaki değişikliklerin sadece beyinde değil, aynı zamanda periferde de meydana geldiğini göstermektedir 6,7,8,9,10. Yöntem ayrıca diabetes mellitus ve obezite dahil olmak üzere diğer durum ve hastalıkların araştırılmasına da izin verir 11,12,13. Multipl skleroz hastalarında gen ekspresyon paternleri analiz edilebilir veya genel olarak bağışıklık fonksiyonu ve etkileri 14,15,16.
PBMC’ler genellikle adenozin trifosfat (ATP) üretmek için oksidatif fosforilasyona (OXPHOS) güvenir17,18. Bu nedenle, PBMC’ler vekil olarak geniş bir uygulama yelpazesini kapsar. Önceki raporlarda, PBMC’lerin enerji metabolizması, erken kalp yetmezliği19, septik şok20 veya mitokondriyal fonksiyonda cinsiyetle ilişkili farklılıklar4 gibi organ işlev bozukluklarını ele almak için kullanılmıştır. PBMC’lerin kriyoprezervasyonu, izolasyonu ve kültivasyonu için genelleştirilmiş bir yöntem, farklı enstitülerde elde edilen sonuçların karşılaştırılabilirliğinde avantajlara sahip olacaktır. Her adım21,22 için protokollerde büyük farklılıklar vardır, bu yöntemin amacı PBMC’lerde biyoenerjetik ölçümler için bir kılavuz sağlamaktır.
Bu makalede, PBMC’lerde biyoenerjetik parametreleri ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. PBMC’lerin biyoenerjetik maddelerinin insan kanından izole edilmesi, dondurularak saklanması ve ölçülmesi yöntemlerini açıklıyoruz. Bu yöntem, hastalarda biyoenerjetik parametrelerin belirlenmesi ve klinik bağlamda değerlendirilmesi için kullanılabilir. Bu ölçümleri uygulamak için, araştırmacıların taze kan örneklerinin alınabileceği bir hasta popülasyonuna erişmeleri gerekir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC’ler) biyoenerjetik analizler için uygun bir şekilde insan kanından izole edilmesi ve dondurularak saklanması için bir araç sağlar. Açıklanan yöntem, PBMC’leri nazikçe ve büyük miktarlarda, yüksek canlılık ve biyoenerjetik ölçümler için yeterli hücrelerle izole etme imkanı sunar. Minimum kesintilerle bile uzun izolasyonların meydana gelmesi dezavantajına sahiptir, ancak daha sonra kriyoprezervasyon, biyoenerjetik enerjinin zamandan bağım…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kan alımı için Giessen-Marburg Üniversite Hastanesi’nin klinik ekibine teşekkür ederiz. Bu çalışma Justus Liebig üniversitesi tarafından finanse edildi.
Materials
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | – | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | – | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | – | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | – | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | – | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | – | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | – | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | – | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | – | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | – | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | – | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
References
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer’s disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biology. 8 (2), 48 (2019).
- Kleiveland, C. R., Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. , (2015).
- Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
- Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
- Schindowski, K., et al. Impact of aging. NeuroMol Med. 4 (3), 161-177 (2003).
- Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer’s disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
- Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
- Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
- Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
- Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
- Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
- Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
- Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
- Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
- Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
- Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
- Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
- Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
- Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
- Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
- Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M. Mitochondrial diseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63, 1-29 (2013).
