Summary

الحفظ بالتبريد وتقييم الطاقة الحيوية لخلايا الدم البشرية أحادية النواة المحيطية

Published: October 20, 2023
doi:

Summary

يمكن استخدام خلايا الدم أحادية النواة المحيطية المعزولة لتحليل وظائف واضطرابات المناعة أو أمراض التمثيل الغذائي أو وظائف الميتوكوندريا. في هذا العمل ، وصفنا طريقة موحدة لإعداد PBMCs من الدم الكامل والحفظ بالتبريد اللاحق. الحفظ بالتبريد يجعل هذا الوقت والمكان مستقلين.

Abstract

تعتمد الوظائف الفسيولوجية للخلايا حقيقية النواة على الطاقة التي توفرها الميتوكوندريا بشكل أساسي. يرتبط ضعف الميتوكوندريا بأمراض التمثيل الغذائي والشيخوخة. تلعب الفسفرة التأكسدية دورا حاسما؛ لأنها ضرورية للحفاظ على الاتزان الداخلي النشط. تم تحديد PBMCs كعينة طفيفة التوغل لقياس وظيفة الميتوكوندريا وقد ثبت أنها تعكس ظروف المرض. ومع ذلك ، يمكن أن يكون قياس وظيفة الطاقة الحيوية للميتوكوندريا محدودا بعدة عوامل في العينات البشرية. القيود هي كمية العينات المأخوذة ، ووقت أخذ العينات ، والذي غالبا ما ينتشر على مدى عدة أيام ، والمواقع. يمكن أن يضمن الحفظ بالتبريد للعينات المجمعة جمع العينات وقياسها بشكل متسق. يجب توخي الحذر للتأكد من أن المعلمات المقاسة قابلة للمقارنة بين الخلايا المحفوظة بالتبريد والخلايا المحضرة حديثا. هنا ، نصف طرق عزل وحفظ PBMCs بالتبريد من عينات الدم البشري لتحليل وظيفة الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في هذه الخلايا. يظهر PBMC المحفوظ بالتبريد وفقا للبروتوكول الموصوف هنا اختلافات طفيفة فقط في عدد الخلايا وصلاحيتها ، ومستويات أدينوسين ثلاثي الفوسفات ، ونشاط السلسلة التنفسية المقاسة مقارنة بالخلايا التي تم حصادها حديثا. هناك حاجة فقط إلى 8-24 مل من دم الإنسان للمستحضرات الموصوفة ، مما يجعل من الممكن جمع العينات أثناء الدراسات السريرية متعددة المراكز وتحديد الطاقة الحيوية في الموقع.

Introduction

تستخدم خلايا الدم البشرية أحادية النواة المحيطية (PBMCs) في تطبيقات مختلفة في العديد من المجالات العلمية ، بما في ذلك دراسة القضايا المناعية والطاقة الحيوية ، مثل تلك المتعلقة بعمليات الشيخوخة أو الأمراض التنكسية 1,2. PBMCs غير متجانسة في التركيب وتتكون من الخلايا الليمفاوية (الخلايا البائية والخلايا التائية والخلايا القاتلة الطبيعية) والوحيدات والخلايا المتغصنة. تظهر الخلايا أحيانا اختلافات واختلافات فردية كبيرة داخل الموضوع ، لذلك يلزم اتخاذ إجراءات موحدة للتعامل مع هذه الخلايا. المعلمات الهامة مثل صلاحية ونقاء العزلة هي المتطلبات الأساسية للتعامل معها وتتأثر بالإضافة إلى ذلك بالعوامل البيئية مثل وقت الجمع ، ومستوى الميلاتونين ، وما إذا كان الموضوع صائما ، وغيرها 3,4.

استنادا إلى الدراسات التي أجريت على الطاقة الحيوية ل PBMCs ، نصف هنا طريقة لعزل PBMCs وحفظها بالتبريد وزراعتها مناسبة للطرق الأخرى أيضا. بينما تعتبر خزعة العضلات المعيار الذهبي لاستقلاب طاقة الميتوكوندريا5 ، فإن فحص خلايا الدم هو إجراء سريع وطفيف التوغل. بالإضافة إلى ذلك ، تشير المزيد والمزيد من الدراسات إلى أن التغيرات في وظيفة الميتوكوندريا في الشيخوخة ومرض الزهايمر (AD) تحدث ليس فقط في الدماغ ولكن أيضا في المحيط6،7،8،9،10. تسمح الطريقة أيضا بالتحقيق في الحالات والأمراض الأخرى ، بما في ذلك داء السكري والسمنة11،12،13. يمكن تحليل أنماط التعبير الجيني لدى مرضى التصلب المتعدد ، أو وظيفة المناعة والتأثيرات عليها بشكل عام14،15،16.

تعتمد PBMCs بشكل عام على الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) لتوليد أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)17,18. لذلك ، تغطي PBMCs مجموعة واسعة من التطبيقات كبدائل. في التقارير السابقة ، تم استخدام استقلاب الطاقة في PBMCs لمعالجة اختلالات الأعضاء ، كما هو الحال في قصور القلب المبكر19 ، أو الصدمة الإنتانية20 أو الاختلافات المرتبطة بالجنس4 في وظيفة الميتوكوندريا. ومن شأن طريقة معممة لعزل الحفظ بالتبريد وزراعة PBMCs أن يكون لها مزايا في إمكانية مقارنة النتائج التي يتم الحصول عليها في مختلف المعاهد. هناك قدر كبير من الاختلاف في البروتوكولات لكل خطوة21,22 ، والهدف من هذه الطريقة هو توفير إرشادات لقياسات الطاقة الحيوية في PBMCs.

في هذه المقالة نصف طريقة لقياس معلمات الطاقة الحيوية في PBMCs. نفسر طرق عزل وحفظ وقياس الطاقة الحيوية ل PBMCs من دم الإنسان. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد معلمات الطاقة الحيوية في المرضى وتقييمها في سياق سريري. لتطبيق هذه القياسات ، يحتاج الباحثون إلى الوصول إلى مجموعة من المرضى يمكن الحصول منها على عينات دم جديدة.

Protocol

تمت مراجعة جميع البروتوكولات الموضحة في هذه المخطوطة لجمع الدم وعزله وتحليله والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة غيسن بألمانيا. تم الحصول على موافقة المرضى على تضمين عيناتهم في الدراسة. يتم تنفيذ جميع خطوات العزل وزراعة الخلايا تحت خزانة السلامة البيولوجية. <p class="jove_…

Representative Results

صلاحية الخلية وعددهالتحقيق العزل الناجح والحفظ بالتبريد ، يجب أن يكون عدد الخلايا وصلاحيتها عالية قدر الإمكان. قبل وبعد الحفظ بالتبريد ، يتم عد الخلايا ، ويتم تحديد صلاحيتها لضمان صحة وجودة الخلايا. الشكل 3 هو توضيح تمثيلي ل PBMCs قبل وبعد الحفظ بالتبريد ، بالكاد ?…

Discussion

يوفر هذا البروتوكول وسيلة لعزل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) وحفظها بالتبريد من دم الإنسان بطريقة مناسبة لتحليلات الطاقة الحيوية. توفر الطريقة الموصوفة إمكانية عزل PBMCs بلطف وبكميات كبيرة ، مع قابلية عالية للبقاء وخلايا كافية لقياسات الطاقة الحيوية. من عيوبه أنه حتى مع الحد الأدن…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نشكر الفريق السريري في مستشفى جامعة غيسن ماربورغ على جمع الدم. تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة جوستوس ليبيغ.

Materials

0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) Self-prepared
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer Self-prepared
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) Self-prepared
1.01 mM DTBB Self-prepared
10 % Triton X-100 Self-prepared
10 mM Oxalacetat Self-prepared
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly Sarstedt 156353_v
37% HCl Carl Roth GmbH & Co. KG
70% Ethanol (EtOH) Self-prepared
Acetyl-CoA Pancreac Applichem A3753
ADP Sigma-Aldrich A5285
Alcohol wipes  (70% isopropyl alcohol)
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Aqua (bidest.) With MilliQ Academic (self-made)
Ascorbate Sigma-Aldrich A4034
ATP-Standard Sigma-Aldrich 6016949
Biocoll Seperating Solution Biochrom 6115
Biological safty cabinet MSC Advantage Thermo Fisher Scientific Inc.
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cell counter TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R Thermo Fisher Scientific Inc.
Counting slides, dual chamber for cell counter Bio-Rad 1450016
Cryotube Cryo.S Grainer Bio-One 126263-2DG
Digitonin Sigma-Aldrich 37008
Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck 102952
Disinfection spray
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl.
Distrips (12.5 ml) DistriTips Gilson F164150
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) Gibco (Thermo Scientific) 15217168
Ethanol (EtOH 100%) Carl ROTH GmbH & Co. KG 9065.3
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665
Frezer (-80°C) Thermo Fisher Scientific Inc.
Glutamate Sigma-Aldrich G1626
Holder/adapter 
Incubator Midi 40 CO2 Thermo Fisher Scientific Inc.
Injection syringe Hamilton
Malate Sigma-Aldrich M-1000
MIR05 Self-prepared
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific Inc. 10110051
Multireader CLARIOstar BMG Labtech
Nitrogen tank Locator 6 plus Thermo Fisher Scientific Inc.
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876
Oxalacetate Sigma-Aldrich
Oxygraph-2k Orobororus Instruments
Penicillin-Streptomycin PAA 15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL VWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) Gibco (Thermo Scientific) 11530586
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saccharose Carl ROTH GmbH & Co. KG 9286.2
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Succinate Sigma-Aldrich S2378
Tetramethylphenylendiamin (TMPD) Sigma-Aldrich T3134
Tourniquet/ Blood pressure cuff
Tris(hydroxymethyl)amino-methane Sigma-Aldrich 108382
Triton X-100 Sigma-Aldrich 108643
Trypanblau Biochrom T6146
Vacuum pump Vaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96 Perkin Elmer 6005181
Water bath WNB22 Memmert GmbH & Co. KG

References

  1. Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer’s disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
  2. Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biology. 8 (2), 48 (2019).
  3. Kleiveland, C. R., Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. , (2015).
  4. Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
  5. Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
  6. Schindowski, K., et al. Impact of aging. NeuroMol Med. 4 (3), 161-177 (2003).
  7. Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer’s disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
  8. Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
  9. Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
  10. Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
  11. Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
  12. Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
  13. Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
  14. Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
  15. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
  16. Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
  17. Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
  18. Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
  19. Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
  20. Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
  21. Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
  22. Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
  23. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  24. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
  25. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
  26. Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M. Mitochondrial diseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63, 1-29 (2013).

Play Video

Cite This Article
Dieter, F., Grube, J., Birkenhauer, T., Quentin, A., Eckert, G. P. Cryopreservation and Bioenergetic Evaluation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (200), e65730, doi:10.3791/65730 (2023).

View Video