Desenvolvimento e aplicação de ensaios biofísicos para avaliação da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS)

A poliubiquitinação de proteínas na célula é um processo fortemente regulado que envolve enzimas da família Ubiquitina Ligase ^1,2. As enzimas terminais na via são as ligases de ubiquitina E3 que ligam covalentemente moléculas de ubiquitina aos seus parceiros de ligação às proteínas³. A poliubiquitinação desses parceiros ligantes de proteínas os direciona para degradação proteolítica pelo proteassoma⁴. Esse sistema faz parte do processo de homeostase proteica que tem sido aproveitado terapeuticamente para induzir a degradação de proteínas envolvidas na doença⁵. Pequenas moléculas que induzem a interação entre as ligases de ubiquitina E3, como a ligase E3 de Von Hippel-Lindau (BVS) ou o cereblon (CRBN), são tipicamente compostas por uma ogiva de ligação à ligase E3 conectada por um ligante flexível a uma ogiva que se liga à proteína alvo de degradação. Essas moléculas heterobifuncionais são comumente referidas como proteólise visando quimeras ou PROTACS⁶.

O desenvolvimento do PROTACS envolve a avaliação da capacidade das moléculas de induzir a degradação de proteínas nas células. Muitos sistemas de ensaios celulares foram desenvolvidos para monitorar a interação induzida entre a proteína-alvo e os componentes da ligase E3, como VHL ou CRBN, após o tratamento das células com uma molécula de PROTAC. Um desses ensaios celulares, o sistema nanoluc-Halotag⁷, envolve uma ligase E3 fundida ao aceitador Halotag e uma proteína-alvo marcada com um doador nanoluc. A formação do complexo ternário aproxima o doador nanoluc e o aceitador Halotag, permitindo a transferência de energia do doador para o receptor, resultando na emissão de luz. Variações desse sistema podem ser usadas para avaliar a permeabilidade celular de moléculas de PROTACS⁸ ou mudanças no nível relativo de ubiquitinação de proteínas-alvo⁹. Enquanto esses sistemas celulares são essenciais para impulsionar a otimização do PROTACS, a formação de complexos entre os ligases E3 e as proteínas alvo de degradação é um processo de várias etapas^10,11. A cinética e termodinâmica das interações binárias e ternárias envolvidas contribuem para a eficiência da ubiquitinação e consequente degradação da proteína^12,13,14.

São descritos protocolos que podem ser adaptados para a caracterização biofísica da formação de complexos ternários induzidos pelo PROTACS utilizando ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Os protocolos SPR e ITC para a molécula MZ1 PROTAC que induz a formação de complexos ternários entre Brd4^BD2 e BVS, derivados de relatos da literatura^13,15 e aqui descritos, foram capazes de recapitular os resultados relatados com algumas modificações dos procedimentos relatados^, que serão discutidos. Uma descrição de um ensaio de BLI usado para avaliar a formação de complexos ternários entre MZI, Brd4^BD2 e BVS está incluída neste relatório. As medidas de afinidade do IPC foram consistentes com as observadas na RP e na CIT. Um protocolo publicado anteriormente no qual um ensaio de SPR foi desenvolvido para avaliar a formação de complexo ternário induzido por PROTAC entre PPM1D, uma proteína fosfatase Ser/Thr cuja expressão é induzida de forma p53-dependente¹⁶, e CRBN também é descrito. Neste caso, a molécula PROTAC tem uma afinidade nanomolar para PPM1D, mas apenas uma afinidade micromolar para CRBN. Neste caso, a ligação da molécula de PROTAC ao CRBN não é saturável, resultando no comumente observado “efeito gancho”. O efeito gancho é uma propriedade de três sistemas corporais em que existem duas espécies que podem formar um complexo heterotrimérico quando ambas estão ligadas a uma molécula em ponte (Figura 1)¹⁷. O efeito gancho é observado quando a espécie em ponte está em concentração excessiva em relação às outras duas espécies. O estado resultante é aquele em que as interações binárias superam as interações ternárias. Os sistemas onde o efeito gancho é observado requerem considerações específicas de planejamento experimental discutidas neste relatório. Conceitos gerais e requisitos de reagentes para avaliar a utilização de ensaios biofísicos para a avaliação da formação de complexos ternários induzidos pelo PROTAC são fornecidos.