キメラを標的としたタンパク質分解による三元複合体形成評価のための生物物理学的アッセイの開発と応用(PROTACS)

細胞内のタンパク質のポリユビキチン化は、ユビキチンリガーゼファミリーの酵素が関与する厳密に制御されたプロセスです^1,2。経路の末端酵素は、ユビキチン分子をタンパク質結合パートナーに共有結合させるE3ユビキチンリガーゼである³。これらのタンパク質結合パートナーのポリユビキチン化は、プロテ^アソームによるタンパク質分解の標的となります4。このシステムは^{、疾患に関与する}タンパク質の分解を誘導するために治療的に活用されているタンパク質の恒常性維持プロセスの一部です5。フォン・ヒッペル・リンダウE3リガーゼ(VHL)やセレブロン(CRBN)などのE3ユビキチンリガーゼ間の相互作用を誘導する低分子は、典型的には、分解の標的となるタンパク質に結合する弾頭に柔軟なリンカーによって接続されたE3リガーゼ結合弾頭から構成される。これらのヘテロ二官能性分子は、一般にキメラを標的とするタンパク質分解またはPROTACS⁶と呼ばれています。

PROTACSの開発には、細胞内のタンパク質の分解を誘導する分子の能力を評価することが含まれます。細胞をPROTAC分子で処理した際に、標的タンパク質とVHLやCRBNなどのE3リガーゼ成分との間の誘導相互作用をモニターする多くの細胞アッセイシステムが開発されています。そのような細胞アッセイの1つであるnanoluc−Halotagシステム⁷は、Halotagアクセプターに融合したE3リガーゼと、nanolucドナーでタグ付けされた標的タンパク質を含む。三元複合体の形成により、ナノルクドナーとハロタグアクセプターが近接し、ドナーからアクセプターへのエネルギーの伝達が可能になり、光が放出されます。このシステムのバリエーションは、PROTACS分子の細胞透過性⁸、または標的タンパク質のユビキ^チン化の相対レベルの変化9を評価するために使用できます。これらの細胞系はPROTACSの最適化を推進するために不可欠であるが、E3リガーゼと分解を標的とするタンパク質との間の複合体の形成は多段階のプロセスである^10,11。関与する二元相互作用と三元相互作用の速度論と熱力学は、効率、ユビキチン化、および結果として生じるタンパク質の分解に寄与します12,13,14。

本明細書には、表面プラズモン共鳴(SPR)、生物層干渉法(BLI)、および等温滴定熱量測定(ITC)を用いて、PROTACSによって誘導される三元複合体形成の生物物理学的特性評価に適合させることができるプロトコルが記載されている。文献レポート^13,15から派生し、ここで説明されているBrd4^BD2とVHLの間の三元複合体形成を誘導するMZ1 PROTAC分子のSPRおよびITCプロトコルは、報告された手順をいくらか修正して報告された結果を要約することができました。このレポートには、MZI、Brd4^BD2、およびVHL間の三元複合体形成を評価するために使用されるBLIアッセイの説明が含まれています。BLIからの親和性測定は、SPRおよびITCで観察されたものと一致していました。発現がp53依存的に誘導されるSer/ThrプロテインホスファターゼであるPPM1DとCRBNの間のPROTAC誘発三元複合体形成を評価するためにSPRアッセイが開発された以前に発表されたプロトコルも記載されています。この場合、PROTAC分子はPPM1Dに対してはナノモル親和性を有するが、CRBNに対してはマイクロモル親和性のみを有する。この場合、PROTAC分子のCRBNへの結合は飽和せず、一般的に観察される「フック効果」が生じます。フック効果は、3つのボディシステムの特性であり、2つの種が架橋分子に結合すると、ヘテロ三量体複合体を形成できます(図1)¹⁷。フック効果は、架橋種が他の2つの種に比べて過剰に集中している場合に観察されます。結果として得られる状態は、二項相互作用が三元相互作用を凌駕する状態です。フック効果が観察されるシステムには、このレポートで説明する特定の実験計画上の考慮事項が必要です。PROTAC誘発三元複合体形成の評価のための生物物理学的アッセイの利用を評価するための一般的な概念と試薬要件が提供されます。