シアル化表現型の異なる単球由来樹状細胞の作製

細胞は、国立血液銀行であるInstituto Português do Sangue e da Transplantação(IPST)によって提供されたボランティアである健康な匿名の献血者のバフィーコートから、書面によるインフォームドナーの同意が得られた後に単離されました(IMP.74.52.4)。血液の使用は、ヒト組織および細胞の提供、調達、検査、加工、保存、保管、および配布の品質と安全性の基準に関する指令2004/23/EC(ポルトガル法22/2007、6月29日)に従って、倫理委員会(IPST 30072015)によって承認されました。IPSTバイオバンクは、保存・抗凝固液であるクエン酸リン酸デキストロース(CPD)が入った特定のプラスチック採取バッグに血液を採取・保管し、処理まで血液の完全性を維持します。生体物質が操作に適しているかどうかを評価するために、 梅毒トレポネーマ、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、およびヒト免疫不全ウイルス(HIV)の血清学的管理が行われ、これらはすべて陰性でなければなりません。本研究では、バフィーコートは、ドナー32の採取日、血清学的結果、血液型、年齢に関する情報とともに、調査目的でIPSTから提供されました。バフィーコートは、室温で最大1日間保存できます。 1. 単球由来樹状細胞の入手 注:ヒトの末梢血を操作する場合は、特定の普遍的な安全対策と適切な物質廃棄を検討する必要があることに言及することが重要です。開始する前に、必要なすべての試薬と材料が準備され、使用する準備ができていることを確認してください。 末梢血単核細胞の単離人間のバフィーコートにアクセスします。注:バフィーコートは、白血球アフェレーシス32によって収集された血液に由来する副産物であり、遠心分離によって白血球が豊富になります。すべてのステップは、垂直フローチャンバーのバイオセーフティキャビネット(BSC)で行いました。 密封されたアウトレットチューブをメスで切断してバフィーコートのパッケージを開き、内容物を50mLのチューブに移します。滅菌済み 15 mL コニカルチューブあたり 7 mL のバフィーコートサンプルを移し、6 mL のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えて予備洗浄を行います。この最初の洗浄ステップは、大量の赤血球(RBC)および血漿からサンプルを洗浄し、密度グラジエント培地によるグラジエント分離用にサンプルを最適化するために必要です( 材料表を参照)。 チューブを室温で1,100 x g で10分間、スイングローター付き遠心分離機でブレーキをオフにして遠心分離します( 材料表を参照)。 遠心分離後、白血球懸濁液(血漿と赤血球の間の白いリング)をパスツールピペットで回収し、新しい滅菌済み15 mLコニカルチューブに移します。 白血球懸濁液を最大10 mLのPBSで満たして次の分離ステップに役立て、ピペッティングで静かに上下させて混合します。 密度グラジエント培地(密度:1.077 g/mL)溶液を調製します:3 mLの密度グラジエント培地を新しい滅菌済み15 mLコニカルチューブに入れ、室温まで温めます。 希釈した白血球懸濁液(ステップ1.1.5から)5 mLを密度勾配培地(5:3)を含むコニカルチューブに添加し、密度勾配分離を行います。密度勾配培地を乱さないようにチューブ壁を使用して、サンプルをゆっくりと一滴ずつ加えます。 グラジエント分離:密度グラジエント培地懸濁液を室温で1,100 x g で30分間、スイングローター付き遠心分離機でブレーキをオフにして遠心分離します。 遠心分離後、遠心分離機から円錐形のチューブを慎重に取り外します。このステップの後、下から順に、赤色層(赤血球および顆粒球)、密度勾配培地、末梢血単核細胞(PBMC)の薄い淡い層、および血漿を含む、明確に定義された層の範囲が表示されます。 パスツールピペットを使用してPBMCの薄層を回収し、密度勾配培地を下に、またはプラズマを上に取りすぎないようにします。PBMC サンプルを新しい 50 mL コニカルチューブに入れ、PBS を 25 mL まで充填し、ピペッティングでゆっくりと上下させてサンプルを混合します。 試料を室温で600 x g (ノーマルブレーキ)で10分間遠心分離し、残留細胞や破片を洗い流し、チューブを慎重に反転させて上清を廃棄します。注:赤血球の汚染が多すぎる場合(細胞ペレットまたはバフィーコートが完全に分離されていないか、赤みがかっているように見える場合に観察される)、残りの赤血球を溶解することをお勧めします。この場合、5 mLのRBC溶解バッファー( 材料表を参照)を加え、十分に混合し、5分間インキュベートします。PBSを最大40 mLまで充填し、サンプルを室温で900 x g (ノーマルブレーキ)で10分間遠心分離し、チューブを慎重に反転させて上清を廃棄します。 サンプルをPBSで10 mLまで満たし、アリコートを取って細胞をカウントします。血小板を除去するには、室温で400 x g (通常のブレーキ)で5分間遠心分離し、チューブを慎重に反転させて上清を廃棄します。注:血小板の数が多い場合は、室温で200 x g (通常のブレーキ)で10分間遠心分離機を2回かけます。血小板は、細胞を数えながらサンプルを視覚化することによって識別されます。 免疫磁気分離による単球単離PBS に 0.5% ウシ血清アルブミン(BSA)および 2 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加して、マイクロビーズバッファーを調製します。濾過(0.2μm)により溶液を滅菌し、緩衝液を冷蔵(2〜8°C)します。 磁気活性化セルソーティング(MACS)による単球CD14+ 単離を実施します。自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした後(ステップ1.4.1)、必要なマイクロビーズバッファーとCD14免疫磁気ビーズ( 材料表を参照)の適切な量を計算します。これらの溶液が氷上に保たれていることを確認してください。1 x 107 細胞あたり80 μLのマイクロビーズバッファーと、1 x 107 細胞あたり20 μLのCD14ビーズを加えます。 細胞ペレットを以前に決定した容量で再懸濁し、4°C(2〜8°C)で15分間インキュベートします。注:PBMCサンプル中の単球レベルの検証が必要な場合は、染色抗体(CD14 [モノクローナルTÜK4]など)を使用してフローサイトメトリー解析を実施してください。ステップ3.2に従って、フローサイトメトリー解析の詳細を確認してください。 1 x 107 細胞あたり1〜2 mLのマイクロビーズバッファーを加え、室温で600 x g (ノーマルブレーキ)で10分間遠心分離して結合していないビーズを除去し、チューブを慎重に反転させて上清を廃棄します。 LSカラムを準備します。LSカラムには強磁性球が含まれており、磁石上に置くと、磁気的に標識された細胞をポジティブで穏やかに保持することができます33。使用直前にLSカラム( 材料表参照)を磁石上に置き、完全に乾燥させないまま3 mLのマイクロビーズバッファーで洗い流し、直ちに次のステップに進んでください。注:収率の低下を防ぐため、手順中はカラムを乾燥させないでください。 細胞ペレットを1 x 108 細胞あたり500 μLのマイクロビーズバッファーに再懸濁します。細胞数が 4 x 108 より大きい場合は、40 μm のセルストレーナーを使用して細胞の凝集を防ぎます。 細胞懸濁液をカラムインレットに添加し、15 mL のコニカルチューブをカラムアウトレットの下に置き、陰性細胞分画を回収し、3 mL のマイクロビーズバッファーでカラムを 3 回洗浄します。陰性画分は、CD14ビーズで収集されなかった細胞(すなわち、CD14− 細胞)を含む。 最終洗浄後、カラムを磁石から取り外し、滅菌済みの 15 mL コニカルチューブに置き、5 mL のマイクロビーズバッファーをカラムインレットにピペットで移し、すぐにシリンジプランジャーをカラムインレットに挿入し、押して目的細胞を分注します。 磁気的に標識された細胞(CD14+ 細胞)を収集し、ステップ1.4.1の説明に従って、アリコートを取って細胞をカウントします。 CD14− 細胞とCD14+ 細胞の両方の細胞分画を、室温で600 x g で10分間遠心分離します(通常のブレーキ)。上清を廃棄し、次のステップのためにCD14+ 画分を保持し、必要に応じて共培養アッセイなどの将来のアッセイのためにCD14− 画分を保存します。必要に応じて、CD14− 画分由来の細胞をRPMI-1640 20% FBSおよび10% DMSOで−80°Cで凍結保存することができる。 樹状細胞への単球分化RPMI-1640ベース培地(11.1 mMグルコースを含む)に10%ウシ胎児血清(FBS)、2 mMのL-グルタミン1%、非必須アミノ酸(NEAA)1%、ピルビン酸ナトリウム1%、および100 μg/mLペニシリン/ストレプトマイシン1%を添加して、完全なRPMI-1640培地を調製します( 材料表を参照)。 単球をmo-DCに分化させ、5~6日かけて行います。得られたCD14+ 細胞の数に必要な培地の体積を計算し、以下の実験セットアップに従って細胞をプレーティングします。注:このプロトコルでは、細胞死および測定誤差を考慮するために、細胞を1.3 x 106 細胞/mLの濃度でプレーティングし、1,000 U/mLのGM-CSFおよび750 U/mLのIL-4( 材料表を参照)を完全な培地に添加し、完全に混合することによって培地を調製しました。 CD14+ 細胞に適切な量の培地を添加し、パスツールピペットでピペッティングして上下に再懸濁します。細胞懸濁液を24ウェルプレート(ウェルあたり:1.3 x 106 細胞/mL)に播種し、37°Cの培養インキュベーターで5% CO2でインキュベートします。 培地を交換し、2〜3日ごとに(通常は分化プロセスごとに1回)新鮮なサイトカインを添加します。これを行うには、細胞を乱すことなく培地の半分を慎重に除去します。ステップ1.3.2.1の注で前述したように、適切な濃度のサイトカインを含む同量の新鮮な培地を添加し、残りの分化期間インキュベートします。注:DCは、単球と分化する場合、緩く接着する細胞です。完全に分化した未熟mo-DCは、紡錘体型で、自由に浮遊し、緩やかに接着する細胞です。細胞はまた、特に成熟するとロゼットを形成することがあります34。 分化後の細胞を採取するには、マイクロピペットを使用して細胞懸濁液全体を滅菌コニカルチューブに移し、プレートのウェルをPBSで2回洗浄し、底部を軽くたたきます(図1A)。注:密着性の高い細胞はおそらくマクロファージであるため、収集しないでください。細胞の不適切な成熟や活性化を避けるために、細胞の取り扱いには細心の注意を払ってください。 細胞を室温で180 x g (通常のブレーキ)で10分間遠心分離し、残留物や死細胞を除去し、実験セットアップに適した培地/バッファーに再懸濁します。 mo-DCの熟成を行います。mo-DCの成熟が必要な場合は、以前に使用した細胞濃度の例(1.3 x 10 6 cells/mL)を考慮してウェルプレートまたはフラスコを使用し、IL-1β(10 ng/mL)、IL-6 (1,000 U/mL)、プロスタグランジンE2(PGE2;1 μg/mL)からなるサイトカインカクテルを培地に添加してサイトカインカクテルを投与します。 および腫瘍壊死因子-α(TNF-α; 10 ng/mL)( 材料表を参照)。細胞を37°Cで5%CO2 で24時間または48時間インキュベートします。 細胞のカウントと生存率細胞カウントとトリパンブルー染色を行います。細胞数と細胞懸濁液の生存率を測定するには、細胞懸濁液から10 μLのアリコートを採取し、10 μLのトリパンブルー(1:1希釈)と混合します。 前のミックスを10 μL取り、自動セルカウンターを使用して、メーカーの指示に従って細胞数をカウントします。注:細胞の濃度が高すぎる場合は、アリコートを希釈し、細胞計数後に、計算で希釈係数を考慮してください。 実験セットアップの細胞数と培地/バッファーを調整します。 細胞生存率とアポトーシスを決定する30。注:この研究では、シアリダーゼ処理(セクション2)に続いて、生存率アッセイを実施しました。mo-DC を 5 μg/mL の 7-アミノアクチノマイシン D(7-AAD)およびアネキシン V で染色し、メーカーの指示に従ってアポトーシスを決定します( 材料表を参照)。 フローサイトメトリー29,30を使用して結果を解析します。 2. シアリダーゼによる細胞の処理 注:mo-DCへの分化後、6日目に、細胞はシアリダーゼ処理アッセイの準備が整います。 目的の実験セットアップを考慮して、1.3 x 10 6 cells/well の 24 ウェルプレートの 10 ウェルから ~10 x 106 mo-DC を回収し、新しい滅菌 15 mL コニカルチューブに移します。注:ある程度のセル損失を想定します。通常、この段階では、mo-DCとその前駆体は増殖せず、mo-DCへの分化中に20%の生存率の損失を経験するため、検出される濃度は1.3 x 106 細胞/mLです。 室温で300 x g (通常のブレーキ)で5〜7分間遠心分離し、上清を捨てて死細胞と破片を除去します。 10 mLのRPMI-1640培地(11.1 mMグルコースを含む)を加え、室温で300 x g (通常のブレーキ)で4分間遠心分離し、上清を捨て、2 mLのRPMI-1640を加え、完全に混合します。 RPMI-1640 の細胞 1 mL を新しい滅菌マイクロチューブ #1 および #2 に入れます。各マイクロチューブには、約 5 x 106 個の細胞が含まれます。 マイクロチューブ #1 に、 クロストリジウム・パーフリンゲンス由来のシアリダーゼ 500 mU を添加します( 材料表を参照)。マイクロチューブ #2 に、ネガティブコントロールである模擬処理シアリダーゼを添加し、観察された効果がシアル酸の除去に直接関連し、アーチファクトによるものではないかどうかを確認します。模擬処理されたシアリダーゼは、酵素を100°Cで20分間沸騰させることによって得られる熱不活化シアリダーゼです。 37°Cで60分間インキュベートします。 インキュベーション後、細胞を同じ番号(#1および#2)の新しい滅菌15 mLコニカルチューブに入れます。約4 mLの完全なRPMI-1640培地(10Sを含む)を両方のチューブに追加して、酵素反応を停止します。 室温で300× g (ノーマルブレーキ)で4分間遠心分離し、上澄み液を廃棄する。 各チューブに5 mLの完全RPMI-1640培地を加え、ウェルあたり1 mLの細胞をプレーティングします。 3. シアル酸プロファイルの決定 レクチン染色細胞を回収し、室温で300 x g (通常のブレーキ)で5分間洗浄します。 細胞をRPMI-1640 + 10% FBSに再懸濁し、細胞(100,000/100μL)をマイクロチューブに分配します。 RPMI-1640 の 10% FBS で、各レクチン ( Sambucus nigra (SNA) レクチン、ピーナッツ凝集素 (PNA) レクチン、 Maackia amurensis (MAA) レクチン ( 材料表参照) の濃度 0.01 mg/mL を使用して、フローサイトメトリー用の染色を行います。4°Cで30分間インキュベートします。 10% FBSまたは10% BSAを含むPBS1 mLで細胞を洗浄し、室温で300 x g (ノーマルブレーキ)で4分間遠心分離します。 ビオチン化レクチンで染色した細胞に、0.0005 mg/mLのストレプトアビジン-PE( 材料表参照)を添加し、暗所で室温で15分間インキュベートします。細胞を1 mLのPBSで洗浄し、室温で300 x g (通常のブレーキ)で4分間遠心分離します。 上清を廃棄し、各チューブに300 μLの2%パラホルムアルデヒド(PFA 2%)を加えます。チューブを光から保護し、必要に応じて、データが取得されるまで4°Cで保管してください。 サンプル調製から1週間以内にフローサイトメーターを使用してデータを取得します29,30。 フローサイトメトリー細胞を1 mLのPBSに再懸濁し、フローサイトメーターでサンプルを取り込み、すぐにデータを取得します。 データ取得が遅れた場合は、300 μL の 2% PFA に再懸濁し、1 週間以内にデータを取得してください。 共焦点レーザー走査型顕微鏡直径12 mmのポリリジンコーティングガラスカバーガラスに細胞を播種し、室温で5分間インキュベートします。 カバーガラスを室温で100 x g (通常のブレーキ)で1分間遠心分離し、細胞の接着を促進します。 室温で4%PFAで30分間固定してから、PBS中の1%BSAで洗浄します。 FITC標識SNAレクチン(0.01 mg/mL)を使用して、細胞表面のα2,6結合型シアル酸を染色します( 材料表を参照)。 共焦点顕微鏡で画像を取得します( 材料表を参照)。 Zスタック処理後、代表的な共焦点断面画像を選択します。 補正全細胞蛍光(CTCF)を用いて染色強度を分析的に定量します。注:CTCF = 積分密度 − (選択した細胞の面積 × バックグラウンド測定値の平均蛍光)29。 4. mo-DCの成熟プロファイリング 抗体染色とフローサイトメトリー目的の細胞の新しいサンプルを採取して、抗体染色を行います。細胞を室温で300 x g (通常のブレーキ)で5分間洗浄し、細胞をマイクロチューブ(チューブあたり100,000細胞)に分配します。 目的の抗体(ab)、MHI-I、MHC-II、CD80、およびCD86を使用してフローサイトメトリーの染色を行います( 材料表を参照)。 蛍光標識abを暗所で室温で15分間インキュベートします。 細胞を1 mLのPBSで洗浄し、室温で300 x g(通常のブレーキ)で5分間遠心分離します。注:標識のないabを使用する場合は、蛍光標識二次abを添加し、製造元の指示に従って暗所で15分間インキュベートします。細胞を1 mLのPBSで洗浄し、室温で300 x g (通常のブレーキ)で5分間遠心分離します。 すべてのマイクロチューブに最大100 μLのPBSを添加し、細胞を300 μLの2%パラホルムアルデヒド(PFA 2%)に再懸濁し、データ取得までチューブを4°Cの暗所に保ちます。 フローサイトメーターを使用してデータを取得します。注:染色および固定後、サンプルはフローサイトメトリーですぐに、または1週間以内に取得できます。この場合、チューブは暗所で4°Cで保管してください。 5. 酵素結合免疫吸着法(ELISA) 注:この研究では、メーカーの指示に従ってELISAアッセイを使用してIFN-γ産生を測定しました( 材料表を参照)。 プレートをコーティングバッファーでコーティングする場合は、捕捉抗体を希釈し(1:100、捕捉抗体をPBSで)、このワーキング溶液100 μLを各ウェルに移し、室温で一晩インキュベートします。 捕捉抗体を完全に廃棄します。 ブロッキングバッファー(例:PBS + 2% BSA + 0.05% Tween20)を添加し、室温で1時間インキュベートしてからブロッキングバッファーを除去します。 標準試料とサンプルをそれぞれの混合液と希釈液とともに添加し、室温で2時間インキュベートします。洗浄バッファーで5回洗浄します。 ビオチン化検出器抗体を添加し、室温で2時間インキュベートした後、5回洗浄します。 poly-HRP-streptavidin-HSを添加し、室温で30分間インキュベートした後、洗浄バッファーで5回洗浄します。 TMB基質( 材料表を参照)を添加し、使用する試験システムを考慮して室温で最大60分間インキュベートします。洗浄バッファーで5回洗浄します。 450 nmのマイクロプレートリーダーでサンプルを読み取ります。