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Immunology and Infection

Génération de cellules dendritiques dérivées de monocytes avec différents phénotypes sialylés

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65525
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1Associate Laboratory i4HB – Institute for Health and Bioeconomy, NOVA School of Science and Technology,Universidade NOVA de Lisboa, 2UCIBIO – Applied Molecular Biosciences Unit, Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology,Universidade NOVA de Lisboa, 3LAQV and REQUIMTE, Departamento de Química, Faculdade de Ciências e Tecnologia,Universidade NOVA de Lisboa, 4Department of Microbiology and Immunology,Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Oncology,Albert Einstein College of Medicine, 6Stemmatters, Biotecnologia e Medicina Regenerativa SA, Parque de Ciência e Tecnologia Avepark,Zona Industrial da Gandra, 7CDG & Allies – Professionals and Patient Associations International Network (CDG & Allies – PPAIN), Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology,Universidade NOVA de Lisboa

Summary

Un protocole unique et complet pour générer des cellules dendritiques dérivées de monocytes humains désialylés (mo-DCs) à partir de cellules mononucléées isolées du sang périphérique (PBMC) à l’aide d’un traitement à la sialidase est présenté. De plus, des méthodes permettant d’évaluer la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des mo-DC et d’évaluer comment le traitement à la sialidase améliore le niveau de maturation des mo-DC sont décrites.

Abstract

Les acides sialiques sont des monosaccharides chargés négativement que l’on trouve généralement aux extrémités des glycanes de surface cellulaire. En raison de leur hydrophilie et de leurs caractéristiques biophysiques, ils sont impliqués dans de nombreux processus biologiques, tels que la modulation de la réponse immunitaire, la reconnaissance des antigènes du soi et du non-soi, les interactions glucides-protéines, etc. Le contenu cellulaire de l’acide sialique est régulé par la sialidase, qui catalyse l’élimination des résidus d’acide sialique. Plusieurs études ont montré que les sialo-glycanes sont essentiels dans la surveillance immunitaire en s’engageant avec les récepteurs Siglec cis et trans-inhibiteurs sur les cellules immunitaires. De même, les points de contrôle glyco-immunitaires dans le cancer deviennent des cibles cruciales pour le développement d’immunothérapies. De plus, les cellules dendritiques (DC) sont considérées comme un composant important des immunothérapies, en particulier dans la recherche sur le cancer, en raison de leur rôle unique en tant que cellules présentatrices d’antigènes (CPA) professionnelles et de leur capacité à déclencher des réponses immunitaires adaptatives et à générer une mémoire immunologique. Néanmoins, la fonction des CD dépend de leur pleine maturation. Les DC immatures ont une fonction opposée aux DC matures et une teneur élevée en acide sialique, ce qui atténue encore leur niveau de maturation. Cela régule à la baisse la capacité des DC immatures à activer les lymphocytes T, ce qui entraîne une réponse immunitaire compromise. Par conséquent, l’élimination de l’acide sialique de la surface cellulaire des DC humains induit leur maturation, augmentant ainsi l’expression des molécules du CMH et la présentation de l’antigène. De plus, il peut restaurer l’expression des molécules co-stimulatrices et de l’IL-12, ce qui permet aux DC d’avoir une plus grande capacité à polariser les lymphocytes T vers un phénotype Th1 et à activer spécifiquement les lymphocytes T cytotoxiques pour tuer les cellules tumorales. Par conséquent, l’acide sialique est apparu comme un modulateur clé des DC et est utilisé comme nouvelle cible pour faire progresser leur utilisation thérapeutique. Cette étude fournit une approche unique pour traiter in vitro les DC dérivés de monocytes avec de la sialidase, visant à générer des populations de DC avec différents phénotypes d’acide sialique à la surface des cellules et des profils de maturation et de co-stimulation adaptés.

Introduction

Les glycanes porteurs d’acide sialique (sialoglycanes) ont suscité un intérêt significatif en raison de leur rôle immunomodulateur. Le monosaccharide acide sialique, qui est le plus répandu chez l’homme sous forme d’acide N-acétylneuraminique, présente des ligands fondamentaux pour les lectines avec un rôle reconnu en immunologie, tels que les sélectines et les Siglecs. Ces lectines reconnaissent les sialoglycanes soit sur la même cellule (cis), soit sur des cellules différentes (trans) et jouent un rôle important dans les interactions hôte-pathogène et dans diverses activités cellulaires physiologiques et pathologiques 1,2,3. De plus, étant donné que l’acide sialique occupe les positions terminales des glycoconjugués de surface cellulaire, il peut dissimuler les structures sous-jacentes, inhibant ainsi le contact de cellule à cellule via des effets répulsifs non spécifiques ou en obstruant la détection par d’autres lectines4. L’activité d’une variété de sialyltransférases (qui transfèrent les acides sialiques) et de sialidases (qui clivent les liaisons de l’acide sialique) à l’intérieur de la cellule détermine la quantité d’acide sialique présente à la surface. De plus, les sialyltransférases et les sialidases solubles exprimées par l’hôte ou les agents pathogènes peuvent modifier extrinsèquement la quantité d’acide sialique à la surface de la cellule 5,6.

La sialylation aberrante est une caractéristique de plusieurs conditions pathologiques. Dans les maladies auto-immunes, l’hyposialylation peut contribuer à une activation immunitaire effrénée et à des dommages aux organes, car l’acide sialique aide à discriminer les antigènes du soi et à réguler les réponses inflammatoires7. À l’inverse, l’hypersialylation se traduit par la surexpression de sialoglycanes, tels que le sialyl-Tn, les antigènes sialyl-Lewis, l’acide polysialique et les gangliosides, ce qui constitue une caractéristique de certains cancers 8,9. L’hypersialylation dépend également de l’augmentation de l’expression d’enzymes spécifiques telles que la N-acétylglucosaminyltransférase (GNT-V), qui génère des glycanes hypersialylés tri- et/ou tétra-antennaires liés à l’azote, qui ont été associés à la croissance du cancer et aux métastases10. La teneur en acide sialique régule également la stabilité et la fonction des protéines, qui sont essentielles pour le rôle des acteurs oncogènes pertinents11. Par conséquent, une sialylation accrue peut faciliter le développement de tumeurs, de métastases, de résistance aux médicaments et d’évasion immunitaire. De plus, la régulation positive des sialoglycanes permet aux tumeurs d’interagir avec les récepteurs inhibiteurs de Siglec sur les cellules immunitaires et d’éviter la surveillance immunitaire. Pour cette raison, les sialoglycanes sont maintenant considérés comme des points de contrôle glyco-immuns et des cibles thérapeutiques attrayantes. Par exemple, les inhibiteurs de l’axe Siglec-immune font déjà l’objet d’essais cliniques précoces, car le récepteur des cellules immunitaires Siglec (LECtine de type immunoglobuline liant l’acide sialique) joue un rôle immuno-inhibiteur12.

Les enzymes ont été utilisées pour moduler le profil glycane en tant qu’outils d’étude ou de stratégies thérapeutiques13,14. La sialidase a été utilisée pour modifier la malignité des cellules cancéreuses, car les glycanes sialylés tels que le sialyl Lewis X sont essentiels à la migration cellulaire et aux métastases cancéreuses15. Dans le même temps, les inhibiteurs de la sialidase, qui empêchent le clivage de l’acide sialique, ont atteint les cliniques pour le traitement des infections virales dépendantes de l’acide sialique16. Récemment, la modulation de l’acide sialique a suscité un intérêt accru en raison du rôle essentiel des acides sialiques en tant que ligands dans l’axe Siglec-immun, ce qui signifie qu’ils offrent de nouveaux moyens de réduire l’échappement du cancer aux réponses immunitaires. Cet intérêt a été renforcé par la contribution de la lauréate du prix Nobel 2022 Bertozzi et de son équipe à plusieurs stratégies qui clivent sélectivement divers sialoglycanes et améliorent les réponses immunitaires anticancéreuses17. Ainsi, les stratégies à base de saliidase représentent une modalité prometteuse pour la thérapie glyco-immunitaire des points de contrôle. Le glycophénotype des cellules du système immunitaire dépend du type de cellule et de leur statut d’activation. En ce qui concerne les lymphocytes T, les glycanes jouent un rôle clé dans les étapes physiopathologiques du développement des lymphocytes T et de la sélection des thymocytes, de l’activité, de la différenciation et de la prolifération des lymphocytes T18. Par exemple, la polylactosamine sur les glycoprotéines influence les niveaux basaux des lymphocytes B et des lymphocytes T et l’activation des macrophages19. Dans les macrophages, des profils d’expression de glycanes distincts jouent un rôle important dans le recrutement des macrophages dans le microenvironnement tumoral (ETM)20. Par conséquent, l’expression de glycanes liés à l’O et à l’Azote par les cellules immunitaires pourrait être utilisée comme glycobiomarqueurs potentiels pour des approches thérapeutiques dans le traitement du cancer et des maladies auto-immunes.

Les cellules dendritiques (DC) sont des cellules présentatrices d’antigènes spécifiques ayant une capacité unique à déclencher des réponses immunitaires, telles que l’immunité anticancéreuse21. Les CD doivent subir une régulation à la hausse de leurs molécules de CMH présentatrices d’antigènes pour présenter des antigènes aux lymphocytes T (signal 1), des molécules co-stimulatrices pour activer les lymphocytes T (signal 2) et des cytokines pro-inflammatoires, telles que l’IL-12, pour déclencher la prolifération des lymphocytes T auxiliaires de type 1 (signal 3)22. Le profil immunitaire qui en résulte est étroitement régulé et les points de contrôle sont essentiels pour empêcher les cellules saines d’être attaquées. Étant donné que les DC peuvent stimuler diverses réponses immunitaires contre les cellules tumorales, ils sont utilisés comme vaccins à base de cellules, et un nombre important d’études cliniques ont démontré leurs avantages potentiels23,24. Après l’approbation par la FDA du premier vaccin à base de DC en 201025,26, de nombreux autres vaccins à base de DC ont été développés. Les vaccins à base de DC sont principalement produits ex vivo et administrés aux patients pour susciter des réponses immunitaires contre les tumeurs. Cependant, une maturation insuffisante ou brève est actuellement l’un des facteurs limitant l’efficacité clinique des DC et signifie que des cocktails de cytokines coûteux doivent être utilisés. Sans maturation adéquate, les DC ne peuvent pas activer les lymphocytes T dans des circonstances cliniques. Au lieu de cela, les DC expriment des points de contrôle immunitaires et déclenchent une réponse immunitaire tolérogène qui empêche les lymphocytes T cytotoxiques d’agir contre les cellules tumorales.

Les DC humains ont des surfaces fortement sialylées, et cette sialylation diminue avec la maturation et au cours d’une réponse immunitaire globale27. La maturation des DC peut être induite par l’élimination de ces acides sialiques avec la sialidase. La désialylation régule fortement à la hausse diverses cytokines, y compris l’IL-12, en raison de la translocation du facteur de transcription NF-kB vers le noyau 6,28. De plus, la désialylation améliore la présentation croisée de l’antigène par le biais des réponses immunitaires du CMH-I et des antitumoraux29,30. En conséquence, le knock-out des sialyltransférases ST3Gal.l et ST6Gal.l, qui jouent un rôle majeur dans la sialylation des DC, génère un phénotype plus mature chez les DCmurins 31.

Le traitement par la sialidase fournit une méthode pour stimuler tous les aspects de la maturation des DC, y compris l’augmentation de la présentation de l’antigène, l’augmentation de l’expression des molécules co-stimulatrices et l’augmentation de la production de cytokines, afin de remédier aux lacunes mentionnées ci-dessus et de permettre aux DC de susciter des réponses efficaces. Cet article présente une procédure permettant d’obtenir des DC humains désialysés viables par l’utilisation d’une saliidase bactérienne. Les DC désialylés présentent un profil de maturation amélioré et peuvent être utilisés comme modèles cellulaires pour stimuler les réponses immunitaires antitumorales in vitro. Les DC sont obtenus à partir de monocytes sanguins, qui sont ensuite différenciés in vitro en présence de la cytokine interleukine-4 (IL-4) et du facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytes (GM-CSF). Ce travail décrit également des méthodes basées sur la lectine pour analyser l’acide sialique à la surface des cellules et des méthodes pour immunophénotyper le niveau de maturation DC. La procédure décrite ici peut être utilisée pour désialyler d’autres types de cellules, fournissant ainsi une approche pour étudier le rôle des sialoglycanes, qui sont des points de contrôle glyco-immunitaires vitaux et pertinents dans l’immunomodulation.

Protocol

Des cellules ont été isolées dans les couches leucocytées de donneurs de sang anonymes en bonne santé, qui étaient des volontaires fournis par la banque nationale de sang, l’Instituto Português do Sangue e da Transplantação (IPST), après avoir obtenu le consentement écrit et éclairé du donneur (IMP.74.52.4). L’utilisation du sang a été approuvée par le comité d’éthique (IPST 30072015), conformément à la directive 2004/23/CE sur les normes de qualité et de sécurité pour le don, l’approvisionnement, l’analyse, le traitement, la conservation, le stockage et la distribution de tissus et de cellules humains (loi portugaise 22/2007, 29 juin). La biobanque IPST recueille et stocke le sang dans un sac de collecte en plastique spécifique contenant du citrate de phosphate dextrose (CPD), une solution conservante et anticoagulante, afin de maintenir l’intégrité du sang jusqu’à son traitement. Pour évaluer si le matériel biologique est approprié pour la manipulation, un contrôle sérologique est effectué pour Treponema pallidum, le virus de l’hépatite B (VHB), le virus de l’hépatite C (VHC) et le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), qui doivent tous être négatifs. Pour la présente étude, l’IPST a fourni la couche leucocytaire à des fins d’enquête, ainsi que des informations concernant la date de prélèvement, les résultats sérologiques, le groupe sanguin et l’âge du donneur32 ans. Le pelage leucocytaire peut rester à température ambiante pendant un maximum de 1 jour. 1. Obtention de cellules dendritiques dérivées de monocytes REMARQUE : Il est important de mentionner que lorsque du sang périphérique humain est manipulé, il faut tenir compte des précautions de sécurité universelles spécifiques et de l’élimination appropriée des matériaux. Avant de commencer, assurez-vous que tous les réactifs et le matériel nécessaires sont préparés et prêts à l’emploi. Isolement des cellules mononucléées du sang périphériqueAccédez au manteau leucocytaire humain.REMARQUE : Le pelage leucocytaire est un sous-produit dérivé du sang recueilli par leucaphérèse32, qui est enrichi en globules blancs par centrifugation. Toutes les étapes ont été réalisées dans une enceinte de sécurité biologique (BSC) à chambre d’écoulement verticale. Ouvrez l’emballage de la couche leucocytaire en coupant le tube de sortie scellé à l’aide d’un scalpel et transférez le contenu dans un tube de 50 ml. Transférer 7 mL d’échantillon de couche leucocytaire par tube conique stérile de 15 mL et ajouter 6 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour effectuer un lavage préliminaire. Cette étape initiale de lavage est nécessaire afin de nettoyer l’échantillon de la quantité considérable de globules rouges (GR) et de plasma afin que l’échantillon soit optimisé pour la séparation en gradient avec un milieu à gradient de densité (voir le tableau des matériaux). Centrifuger le tube à température ambiante pendant 10 min à 1 100 x g dans une centrifugeuse avec un rotor pivotant et avec le frein désactivé (voir le tableau des matériaux). Après centrifugation, prélever la suspension leucocytaire (l’anneau blanc entre le plasma et les globules rouges) à l’aide d’une pipette Pasteur et la transférer dans un nouveau tube conique stérile de 15 ml. Remplissez la suspension leucocytaire jusqu’à 10 ml de PBS pour faciliter l’étape de séparation suivante, et mélangez en pipetant doucement de haut en bas. Préparez la solution de milieu à gradient de densité (densité : 1,077 g/mL) : Placez 3 mL de milieu à gradient de densité dans un nouveau tube conique stérile de 15 mL et laissez-le se réchauffer à température ambiante. Ajouter 5 mL de la suspension leucocytaire diluée (à partir de l’étape 1.1.5) dans le tube conique contenant le milieu à gradient de densité (5 :3) pour effectuer la séparation par gradient de densité. Ajouter l’échantillon lentement, goutte à goutte, en utilisant les parois du tube pour éviter de perturber le milieu de gradient de densité. Séparation par gradient : Centrifuger la suspension fluide à gradient de densité à température ambiante pendant 30 min à 1 100 x g dans une centrifugeuse avec un rotor oscillant et avec le frein désactivé. Après la centrifugation, retirez délicatement les tubes coniques de la centrifugeuse. Après cette étape, une série de couches bien définies sont visibles, dont les suivantes, en commençant par le bas : une couche rouge (globules rouges et granulocytes), un milieu de gradient de densité, une fine couche pâle de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) et du plasma. Prélever la fine couche de PBMC à l’aide d’une pipette Pasteur, et éviter d’utiliser le milieu de gradient de densité en dessous ou trop de plasma au-dessus. Placez l’échantillon PBMC dans un nouveau tube conique de 50 mL, remplissez-le jusqu’à 25 mL de PBS et mélangez l’échantillon en pipetant doucement de haut en bas. Centrifuger les échantillons à température ambiante pendant 10 min à 600 x g (frein normal) pour éliminer les cellules résiduelles et les débris, et éliminer le surnageant en retournant soigneusement le tube.REMARQUE : S’il y a trop de contamination par les globules rouges, ce qui est observable lorsque la pastille cellulaire ou la couche leucocytaire n’est pas complètement séparée ou semble rougeâtre, il est recommandé de lyser les globules rouges restants. Dans ce cas, ajouter 5 mL de tampon de lyse des globules rouges (voir le tableau des matériaux), bien mélanger et incuber pendant 5 minutes. Remplir jusqu’à 40 mL de PBS, centrifuger les échantillons à température ambiante pendant 10 min à 900 x g (frein normal) et jeter le surnageant en retournant soigneusement le tube. Remplissez l’échantillon jusqu’à 10 mL de PBS et prenez une aliquote pour compter les cellules. Pour éliminer les plaquettes, centrifuger à température ambiante pendant 5 min à 400 x g (frein normal), et jeter le surnageant en retournant soigneusement le tube.REMARQUE : Dans le cas où il y a un nombre important de plaquettes, centrifuger à température ambiante pendant 10 min à 200 x g (frein normal) deux fois. Les plaquettes sont identifiées en visualisant l’échantillon lors du comptage des cellules. Isolement des monocytes par séparation immunomagnétiquePréparez le tampon de microbilles en complétant le PBS avec 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Stériliser la solution par filtration (0,2 μm) et conserver le tampon au réfrigérateur (2-8 °C). Effectuer l’isolement des monocytes CD14+ par tri cellulaire activé magnétiquement (MACS).Après le comptage cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules automatisé (étape 1.4.1), calculer le volume approprié de tampon de microbilles et de billes immunomagnétiques CD14 (voir le tableau des matériaux) requis. Assurez-vous que ces solutions sont conservées sur la glace. Ajouter 80 μL de tampon de microbilles pour 1 x 10 7 cellules et 20 μL de billes CD14 pour 1 x 107 cellules. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans les volumes précédemment déterminés et incuber pendant 15 min à 4 °C (2-8 °C).REMARQUE : Dans le cas où il est nécessaire de vérifier les niveaux de monocytes dans les échantillons PBMC, effectuer une analyse par cytométrie en flux à l’aide d’anticorps de coloration (par exemple, CD14 [TÜK4 monoclonal]). Suivez l’étape 3.2 pour plus de détails sur l’analyse par cytométrie en flux. Ajouter 1 à 2 mL de tampon à microbilles par 1 x 107 cellules, centrifuger à température ambiante pendant 10 min à 600 x g (frein normal) pour éliminer les billes non liées, et jeter le surnageant en retournant soigneusement le tube. Préparez la colonne LS. Les colonnes LS contiennent des sphères ferromagnétiques qui, lorsqu’elles sont placées sur un aimant, permettent une rétention positive et douce des cellules marquées magnétiquement33. Immédiatement avant l’utilisation, placez une colonne LS (voir le tableau des matériaux) sur l’aimant, rincez avec 3 mL de tampon à microbilles sans sécher complètement, et passez immédiatement à l’étape suivante.REMARQUE : Ne laissez jamais la colonne sécher pendant la procédure pour éviter de compromettre le rendement. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 μL de tampon de microbilles par 1 x 108 cellules. Si le nombre de cellules est supérieur à 4 x 108, utilisez une crépine de 40 μm pour empêcher l’agrégation des cellules. Ajouter la suspension cellulaire à l’entrée de la colonne, placer un tube conique de 15 mL sous la sortie de la colonne pour recueillir la fraction cellulaire négative et laver la colonne trois fois avec 3 mL de tampon à microbilles. La fraction négative comprend les cellules qui n’ont pas été collectées avec les billes CD14 (c’est-à-dire les cellules CD14− ). Après le lavage final, retirez la colonne de l’aimant, placez-la sur un tube conique stérile de 15 ml, pipetez 5 ml de tampon à microbilles dans l’entrée de la colonne et insérez immédiatement le piston de la seringue dans l’entrée de la colonne et poussez pour distribuer les cellules cibles. Prélever les cellules marquées magnétiquement (cellules CD14+ ) et prendre une aliquote pour compter les cellules, comme décrit à l’étape 1.4.1. Centrifuger les deux fractions cellulaires, les cellules CD14− et CD14+, à température ambiante pendant 10 min à 600 x g (frein normal). Éliminez le surnageant, conservez la fraction CD14+ pour les étapes suivantes et conservez-la pour des tests ultérieurs, tels que des tests de co-culture, si nécessaire. Si nécessaire, les cellules de la fraction CD14− peuvent être cryoconservées dans du RPMI-1640 à 20 % de FBS et à 10 % de DMSO à −80 °C. Différenciation des monocytes en cellules dendritiquesPréparer le milieu complet RPMI-1640 en complétant le milieu de base RPMI-1640 (contenant 11,1 mM de glucose) avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 1 % de 2 mM de L-glutamine, 1 % d’acides aminés non essentiels (NEAA), 1 % de pyruvate de sodium et 1 % de 100 μg/mL de pénicilline/streptomycine (voir le tableau des matériaux). Effectuer la différenciation des monocytes en mo-DC, qui se produit sur ~5-6 jours.Calculer le volume de milieu nécessaire pour le nombre de cellules CD14+ obtenues, et plaquer les cellules selon la configuration d’expérience suivante.NOTA : Dans ce protocole, les cellules ont été plaquées à une concentration de 1,3 x 106 cellules/mL pour tenir compte de la mort cellulaire et des erreurs de mesure, et le milieu a été préparé en ajoutant 1 000 U/mL de GM-CSF et 750 U/mL d’IL-4 (voir le tableau des matériaux) dans un milieu complet et en le mélangeant soigneusement. Ajouter le volume approprié de milieu dans les cellules CD14+ et remettre en suspension en pipetant de haut en bas avec une pipette Pasteur. Plaquer la suspension cellulaire en plaques de 24 puits (par puits : 1,3 x 106 cellules/mL) et incuber dans un incubateur de culture à 37 °C avec 5 % de CO2. Changez le milieu de culture et complétez-le avec des cytokines fraîches tous les 2-3 jours (généralement une fois par processus de différenciation). Pour ce faire, retirez soigneusement la moitié du milieu de culture sans perturber les cellules. Ajouter la même quantité de milieu frais avec la concentration appropriée de cytokines, comme décrit précédemment dans la note de l’étape 1.3.2.1, et incuber pendant la période de différenciation restante.REMARQUE : Les DC, lorsqu’ils se différencient des monocytes, sont des cellules faiblement adhérentes. Les mo-DC immatures entièrement différenciés sont des cellules fusiformes, flottantes et faiblement adhérentes. Les cellules peuvent également former des rosettes, surtout à maturité34. Pour prélever les cellules après différenciation, utilisez une micropipette pour transférer l’ensemble de la suspension cellulaire dans un tube conique stérile, et lavez les puits de la plaque deux fois avec du PBS, en tapotant doucement sur le fond (Figure 1A).REMARQUE : Évitez de collecter les cellules fortement adhérentes, car il s’agit probablement de macrophages. Pour éviter une maturation ou une activation inadéquate des cellules, assurez-vous que les cellules sont manipulées avec un soin extrême. Centrifuger les cellules à température ambiante pendant 10 min à 180 x g (frein normal) pour éliminer les résidus ou les cellules mortes, et les remettre en suspension dans le milieu/tampon approprié pour le dispositif expérimental. Effectuer la maturation des mo-DCs.Dans le cas où la maturation des mo-DC est nécessaire, utiliser une plaque à puits ou un flacon, en tenant compte de l’exemple de concentration cellulaire qui a été utilisé précédemment (1,3 x 10 6 cellules/mL), et administrer un cocktail de cytokines en complétant le milieu avec un cocktail de cytokines comprenant l’IL-1β (10 ng/mL), l’IL-6 (1 000 U/mL), la prostaglandine E2 (PGE2 ; 1 μg/mL), et le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α ; 10 ng/mL) (voir le tableau des matériaux). Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 h ou 48 h. Comptage et viabilité des cellulesEffectuez le comptage cellulaire et la coloration au bleu trypan.Pour déterminer le nombre de cellules et la viabilité d’une suspension cellulaire, prélevez une aliquote de 10 μL de la suspension cellulaire et mélangez-la avec 10 μL de bleu de trypan (dilution 1 :1). Prenez 10 μL du mélange précédent et utilisez le compteur de cellules automatisé pour compter le nombre de cellules selon les instructions du fabricant.REMARQUE : Si la concentration de cellules est trop élevée, diluez l’aliquote et, après le comptage des cellules, tenez compte du facteur de dilution dans les calculs. Ajustez le nombre de cellules et le milieu/tampon pour la configuration expérimentale. Déterminer la viabilité cellulaire et l’apoptose30.NOTE : Dans ce travail, après le traitement à la sialidase (section 2), le test de viabilité a été effectué.Colorer les mo-DC avec 5 μg/mL de 7-aminoactinomycine D (7-AAD) et d’annexine V, et déterminer l’apoptose selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Analyser les résultats à l’aide de la cytométrie en flux29,30. 2. Traitement des cellules avec de la sialidase REMARQUE : Après la différenciation en mo-DC, le sixième jour, les cellules sont prêtes pour le test de traitement à la sialidase. En tenant compte de la configuration expérimentale souhaitée, prélever ~10 x 106 mo-DC à partir de 10 puits des plaques de 24 puits avec 1,3 x 106 cellules/puits, et les transférer dans un nouveau tube conique stérile de 15 ml.REMARQUE : Supposons une certaine perte de cellules ; En règle générale, à ce stade, la concentration trouvée est de 1,3 x 106 cellules/mL parce que les mo-DC et leurs précurseurs ne prolifèrent pas et subissent une perte de viabilité de 20 % lors de la différenciation en mo-DC. Centrifuger à température ambiante pendant 5 à 7 min à 300 x g (frein normal) et jeter le surnageant pour éliminer les cellules mortes et les débris. Ajouter 10 mL de milieu RPMI-1640 (contenant 11,1 mM de glucose), centrifuger à température ambiante pendant 4 min à 300 x g (frein normal), jeter le surnageant, ajouter 2 mL de RPMI-1640 et bien mélanger. Placer 1 mL de cellules dans le RPMI-1640 dans de nouveaux microtubes stériles, #1 et #2 ; Chaque microtube contiendra environ 5 x 106 cellules. Au microtube #1, ajouter 500 mU de sialidase de Clostridium perfringens (voir le tableau des matériaux). Au microtube #2, ajouter de la saliidase traitée fictivement, qui est un témoin négatif, pour confirmer si les effets observés sont directement liés à l’élimination de l’acide sialique et ne sont pas dus à des artefacts. La sialidase traitée par simulation est une sialidase inactivée par la chaleur, qui est obtenue en faisant bouillir l’enzyme pendant 20 min à 100 °C. Incuber pendant 60 min à 37 °C. Après l’incubation, placez les cellules dans de nouveaux tubes coniques stériles de 15 ml avec la même numérotation, #1 et #2. Ajouter environ 4 mL de milieu complet RPMI-1640 (contenant 10 % de FBS) dans les deux tubes pour arrêter la réaction enzymatique. Centrifuger à température ambiante pendant 4 min à 300 x g (frein normal) et jeter le surnageant. Ajouter 5 mL de milieu RPMI-1640 complet dans chaque tube et plaquer 1 mL de cellules par puits. 3. Détermination du profil d’acide sialique Coloration de la lectineRecueillir et laver les cellules à température ambiante pendant 5 min à 300 x g (frein normal). Remettre les cellules en suspension dans RPMI-1640 + 10 % FBS et répartir les cellules (100 000/100 μL) dans les microtubes. Effectuer la coloration pour la cytométrie en flux dans le RPMI-1640 avec 10 % de FBS en utilisant une concentration de 0,01 mg/mL pour chaque lectine : lectine de Sambucus nigra (SNA), lectine d’agglutinine d’arachide (PNA) et lectine de Maackia amurensis (MAA) (voir le tableau des matériaux). Incuber pendant 30 min à 4 °C. Laver les cellules avec 1 mL de PBS contenant 10 % de FBS ou 10 % de BSA, et centrifuger à température ambiante pendant 4 min à 300 x g (frein normal). Aux cellules colorées avec les lectines biotinylées, ajouter 0,0005 mg/mL de streptavidine-PE (voir le tableau des matériaux) et incuber pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Laver les cellules avec 1 mL de PBS et centrifuger à température ambiante pendant 4 min à 300 x g (frein normal). Jeter le surnageant et, dans chaque tube, ajouter 300 μL de paraformaldéhyde à 2 % (PFA 2 %). Protégez les tubes de la lumière et, si nécessaire, stockez-les à 4 °C jusqu’à l’acquisition des données. Acquérir les données à l’aide d’un cytomètre en flux dans un délai de 1 semaine après la préparation de l’échantillon29,30. Cytométrie en fluxRemettre les cellules en suspension dans 1 mL de PBS et prélever l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux pour une acquisition immédiate des données. Pour l’acquisition retardée des données, remettre en suspension 300 μL de PFA à 2 % et acquérir les données dans un délai de 1 semaine. Microscopie confocale à balayage laserPlaquer les cellules sur des lamelles en verre recouvertes de polylysine de 12 mm de diamètre et incuber pendant 5 min à température ambiante. Centrifuger les lamelles à température ambiante pendant 1 min à 100 x g (frein normal) pour favoriser l’adhérence des cellules. Fixer à température ambiante pendant 30 min avec 4% de PFA avant de laver avec 1% de BSA dans du PBS. Utiliser la lectine SNA conjuguée FITC (0,01 mg/mL) pour colorer les acides sialiques liés à l’α2,6 à la surface des cellules (voir le tableau des matériaux). Acquérir des images au microscope confocal (voir le tableau des matériaux). Après le traitement de la pile Z, sélectionnez des images de coupe confococ représentatives. Quantifier analytiquement l’intensité de la coloration à l’aide de la fluorescence cellulaire totale corrigée (CTCF).REMARQUE : CTCF = Densité intégrée − (Aire de la cellule sélectionnée × Fluorescence moyenne des lectures de fond)29. 4. Profilage de maturation des mo-DC Marquage d’anticorps et cytométrie en fluxPrélever un nouvel échantillon des cellules d’intérêt pour effectuer la coloration des anticorps. Lavez les cellules à température ambiante pendant 5 min à 300 x g (frein normal) et répartissez-les dans les microtubes (100 000 cellules par tube). Effectuer la coloration pour la cytométrie en flux à l’aide des anticorps souhaités (ab), MHI-I, MHC-II, CD80 et CD86 (voir le tableau des matériaux). Incuber l’ab conjugué par fluorescence pendant 15 min à température ambiante dans l’obscurité. Laver les cellules avec 1 mL de PBS et centrifuger à température ambiante pendant 5 min à 300 x g (frein normal).REMARQUE : Si vous utilisez de l’ab non étiqueté, ajoutez de l’ab secondaire conjugué par fluorescence et incubez dans l’obscurité pendant 15 minutes selon les instructions du fabricant. Lavez les cellules avec 1 mL de PBS et centrifugez à température ambiante pendant 5 min à 300 x g (frein normal). À tous les microtubes, ajoutez jusqu’à 100 μL de PBS, remettez les cellules en suspension dans 300 μL de paraformaldéhyde à 2 % (PFA 2 %) et maintenez les tubes dans l’obscurité à 4 °C jusqu’à l’acquisition des données. Acquérez les données à l’aide d’un cytomètre en flux.REMARQUE : Après la coloration et la fixation, les échantillons peuvent être acquis par cytométrie en flux immédiatement ou dans un délai de 1 semaine. Dans ce cas, conservez les tubes à 4 °C dans l’obscurité. 5. Test immuno-enzymatique (ELISA) NOTA : Dans le cadre de ce travail, la production de γ IFN a été mesurée à l’aide du test ELISA conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Pour enrober la plaque dans un tampon de revêtement, diluer l’anticorps de capture (1 :100, anticorps de capture dans le PBS), transférer 100 μL de cette solution de travail dans chaque puits et incuber pendant la nuit à température ambiante. Éliminez complètement l’anticorps de capture. Ajouter le tampon bloquant (p. ex., PBS + 2 % BSA + 0,05 % Tween20) et incuber pendant 1 h à température ambiante avant de retirer le tampon bloquant. Ajouter l’étalon et l’échantillon, avec le mélange et les dilutions respectifs, et incuber pendant 2 h à température ambiante. Laver cinq fois avec un tampon de lavage. Ajouter l’anticorps détecteur biotinylé et incuber pendant 2 h à température ambiante, suivi de cinq lavages. Ajouter le poly-HRP-streptavidin-HS et incuber pendant 30 min à température ambiante, suivi de cinq lavages avec tampon de lavage. Ajouter le substrat TMB (voir le tableau des matériaux) et incuber jusqu’à 60 minutes à température ambiante, en tenant compte du système d’essai utilisé. Laver cinq fois avec un tampon de lavage. Lire les échantillons sur un lecteur de microplaques à 450 nm.

Representative Results

Isolement des monocytes et différenciation des monocytes en mo-DCConformément au protocole, les PBMC humains ont été isolés de la couche leucocytaire à l’aide d’une séparation par gradient de densité avec un milieu à gradient de densité et soigneusement lavés. Le bleu de trypan a été utilisé pour effectuer une numération des cellules viables le jour de l’isolement, comme décrit précédemment à l’étape 1.4.1. Par la suite, l’isolement des monocytes CD14+ a été réalisé par sélection positive. Pour ce faire, les PBMC ont été incubés avec des billes magnétiques contenant un anticorps qui reconnaît l’antigène CD14. Les monocytes CD14+ sélectionnés ont été cultivés dans un milieu supplémenté en GM-CSF et en IL-4 pendant 5 à 6 jours27 pour se différencier en mo-DC immatures (Figure 1A). La maturation des mo-DC peut être obtenue par l’application d’un cocktail de cytokines, dont l’IL-6, l’IL-1β, le TNF-α et la PGE235 (Figure 1A). Au cours du processus de différenciation, à la suite de la stimulation de l’IL-4 et du GMCSF, on s’attend à ce que le phénotype cellulaire change. Les données montrent que les mo-DC perdent l’expression du marqueur de surface CD14, principalement exprimé par les monocytes (Figure 1B), et gagnent une expression significative de CD1a, un marqueur exprimé par les DC humains36,37. Les mo-DC obtiennent également une expression plus élevée de MHC-II (HLA-DR), une molécule présentatrice d’antigène exprimée par les DC humains et d’autres cellules présentatrices d’antigènes38 (Figure 1B). Teneur en acide sialique à la surface des cellulesLe traitement des mo-DC avec de la sialidase réduit la teneur en acide sialique à la surface des mo-DC, ce qui peut être confirmé par la coloration avec des lectines, qui sont des protéines capables de se lier aux glucides39. Étant donné que l’enzyme utilisée élimine à la fois les acides sialiques liés α2,3 et α2,6 de la surface cellulaire, les mo-DC ont été colorés avec du PNA, qui reconnaît l’antigène T-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr, ainsi que les lectines MAA et SNA, qui se lient respectivement à α2,3- et α2,6-sialique. L’efficacité du traitement par la sialidase a été évaluée par cytométrie en flux et par microscopie confocale (Figure 2). Comme le montre la figure 2A, le traitement par la sialidase a significativement diminué la liaison à l’AAM et au SNA tout en augmentant la coloration de l’ANP. La diminution de la coloration des SNA après traitement par la sialidase a été confirmée par une analyse en microscopie confocale montrant une réduction significative de la coloration des SNA à la surface des cellules (Figure 2B). Caractérisation fonctionnelle des mo-DC traités à la saliidaseAfin d’évaluer comment le traitement par la sialidase affecte les fonctions de la mo-DC, le niveau de maturation des mo-DC a été évalué après le traitement par la sialidase. Comme le montre la figure 3A, le traitement par la sialidase conduit à une augmentation significative de l’expression des molécules présentatrices d’antigènes CMH I et CMH II et de l’expression des molécules co-stimulatrices CD80 et CD86. Pour évaluer l’effet de l’élimination de l’acide sialique sur la capacité des mo-DC à induire des réponses des lymphocytes T, des mo-DC traités par la sialidase chargés de lysats de cellules tumorales ont été utilisés pour amorcer les lymphocytes T autologues (Figure 3). Ensuite, le profil des lymphocytes T résultants a été caractérisé en fonction de leur capacité à sécréter la cytokine Th1 IFN-γ. Comme le montre la figure 3B, par rapport aux lymphocytes T amorcés par des mo-DC entièrement sialylés, les lymphocytes T amorcés par des mo-DC traités à la saliidase sécrètent des niveaux significativement plus élevés d’IFN-γ. Ces résultats suggèrent que les mo-DC traités à la sialidase ont une meilleure capacité à amorcer les lymphocytes T autologues. Viabilité cellulaireAprès le traitement par la sialidase, un test de viabilité a été effectué pour s’assurer que le traitement n’était pas cytotoxique pour les cellules. Après le traitement, les mo-DC ont été colorés avec du 7-AAD et de l’annexine V, pour détecter les cellules non viables et apoptotiques, et analysés par cytométrie en flux (Figure 4). Les données ne montrent aucune différence significative dans la viabilité cellulaire entre les cellules non traitées (figure 4, panneau de gauche) et les cellules traitées à la saliidase (figure 4, panneau de droite). Figure 1 : Différenciation des monocytes isolés en mo-DC. (A) Les monocytes CD14+ ont été isolés à partir de couches leucocytes et mis en culture à une concentration de 1,3 x 106 cellules/mL à 37 °C. Les monocytes ont été différenciés dans un milieu supplémenté avec 750 U/mL d’IL-4 et 1 000 U/mL de GM-CSF. Analyse microscopique de la morphologie des monocytes isolés de la couche leucocytaire humaine au jour 0 (image du haut). Mo-DC immatures ; les cellules ont été différenciées pendant une période de 5 jours à l’aide d’IL-4 et de GM-CSF (image du milieu). Les mo-DC matures ont été obtenues en utilisant des cytokines IL-6, IL-1β, TNF-α et PGE2 pendant 24 h (image du bas). Barres d’échelle : 100 μm. (B) Les cellules ont été analysées au jour 0, au jour 2 et au jour 5 tout au long de la période de différenciation à l’aide de la cytométrie en flux. Les anticorps suivants ont été utilisés pour caractériser les marqueurs de surface cellulaire : (a-c) CD14 ; (d-f) CD1a, et (g-i) HLA-DR (CMH classe II). La figure montre des histogrammes représentatifs d’au moins trois essais indépendants. Le panneau (B) a été modifié à partir de Videira et al.40, brevet WO2017002045A1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Traitement à la sialidase des mo-DC humaines pour éliminer les acides sialiques liés aux α2,6- et α2,3 de la surface cellulaire. (A) Analyse des mo-DC par cytométrie en flux par coloration de la lectine pour tester l’efficacité du traitement par la sialidase. Les mo-DC humains ont été traités avec de la sialidase (barres grises) ou laissés non traités (barres blanches) et colorés avec de la lectine SNA (reconnaissant les acides [2,6]-sialique), de la lectine MAA (reconnaissant les acides [2,3]-sialique) et de la lectine PNA (reconnaissant l’antigène T-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr). Les valeurs représentent l’intensité moyenne de fluorescence (MFI) d’au moins trois tests indépendants. La signification statistique a été déterminée à l’aide d’un test t bilatéral apparié (*P < 0,05 ou ***P < 0,0001), se référant à la différence entre les DC non traitées et traitées à la sialidase. Le traitement par la sialidase a diminué la liaison à l’AMA et a augmenté la coloration de l’ANP dans les mo-DC humaines, résultant de l’élimination des acides sialiques liés à l’α(2,3) ; l’élimination des acides sialiques liés à la α(2,6) après traitement à la sialidase a été détectée par une diminution de la coloration au SNA. (B) Microscopie confocale des mo-DC traitées à la sialidase et préparées sur lamelles pour observation. Une série d’images z-stack a été collectée à partir de différentes cellules et traitée pour inclure l’intensité moyenne de coloration. Barres d’échelle : 20 μm. Le panneau (A) a été modifié à partir de Silva et al.30 ; Le panneau (B) a été modifié à partir de Silva et al.29. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Traitement par la sialidase des mo-DC induisant une expression plus élevée des marqueurs de maturation. (A) Les mo-DC traitées par la sialidase ont montré un phénotype de maturation plus élevé que les mo-DC entièrement sialylées. La cytométrie en flux a été utilisée pour évaluer l’expression de plusieurs marqueurs de maturation. Les mo-DC ont été traités par la sialidase pendant 1 h à 37 °C ; les valeurs du graphique représentent l’intensité moyenne de fluorescence (MFI) (moyenne ± MEB) d’au moins trois essais indépendants. Des différences statistiquement significatives ont été calculées à l’aide d’un test t (*P < 0,05, **P < 0,01), se référant à la différence entre les conditions non traitées et traitées à la sialidase. (B) Des mo-DC humains désialylés chargés d’antigènes tumoraux entiers ont induit des réponses spécifiques des lymphocytes T. Les mo-DC ont été traités avec de la sialidase pendant 1 h à 37 °C ou laissés non traités, suivis d’une charge avec des lysats MCF-7 (TL) comme source d’antigènes de cellules tumorales entières. La co-culture entre les mo-DC et les lymphocytes T autologues a été réalisée pendant 4 à 8 jours en présence d’IL-2 (10 U/mL). Les lymphocytes T amorcés avec des mo-DC désialylés ont montré une sécrétion significativement plus élevée de la cytokine Th1, l’IFN-γ. Après stimulation des lymphocytes T avec des mo-DC, les cytokines sécrétées dans les surnageants de co-culture ont été mesurées par ELISA (n = 7). Les valeurs du graphique représentent la concentration (pg/mL) (moyenne ± MEB). Des différences statistiquement significatives ont été calculées à l’aide d’un test t (*P < 0,05). La figure a été modifiée à partir de Silva et al.30. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Absence d’impact du traitement par la sialidase sur la viabilité des mo-DC humaines. Les mo-DC non traités (panneau de gauche) et les mo-DC traités à la sialidase (panneau de droite) ont été soumis à une double coloration avec de l’annexine V et de la 7-AAD, et la coloration a été analysée par cytométrie en flux. Les données n’ont montré aucune différence significative dans la viabilité cellulaire entre les cellules non traitées et les cellules traitées à la sialidase, ce qui suggère que les mo-DC peuvent tolérer le traitement par la sialidase et rester viables pour exercer leur fonction immunologique. La figure a été modifiée à partir de Silva et al.30. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Isolement des monocytes
Ce manuscrit décrit un protocole permettant de générer des mo-DC à partir de monocytes CD14+ isolés chez l’homme (Figure 1A), suivi d’un traitement à la sialidase pour réduire la teneur en acide sialique à la surface de ces cellules.

Il existe différentes façons d’obtenir des DC humains, par exemple directement à partir du sang ou des tissus périphériques ou par différenciation à partir de précurseurs tels que les cellules souches ou les monocytes. L’obtention de DC différenciés des monocytes isolés du sang périphérique est beaucoup plus simple en raison de la facilité d’obtention de grandes quantités de monocytes par rapport à d’autres sources de DC41. Néanmoins, pour obtenir un pourcentage élevé de monocytes isolés, toutes les étapes du protocole doivent être suivies scrupuleusement. Par exemple, le milieu de gradient de densité peut être toxique pour les cellules, et pour prévenir la mort cellulaire, il faut éviter tout contact prolongé des cellules avec le milieu de gradient de densité et laver soigneusement les cellules. La manipulation cellulaire doit être effectuée le plus rapidement possible pour éviter la perte de viabilité cellulaire. À partir des PBMC, les monocytes peuvent être isolés par sélection positive à l’aide de la méthode de tri cellulaire activé magnétiquement (MACS), qui est une technologie appropriée pour produire un grand nombre de monocytes. De plus, par rapport à d’autres méthodes de sélection des monocytes, les mo-DC dérivés de monocytes isolés de MACS possèdent une plus grande capacité à stimuler l’activité antitumorale des lymphocytes T42. Dans ce protocole, une fois isolés, les monocytes ont été incubés avec de l’IL-4 et du GM-CSF pendant une période de 5 à 6 jours pour réaliser la différenciation en mo-DC immatures (Figure 1). Les résultats ont montré que morphologiquement (Figure 1A) et phénotypiquement (Figure 1B), les monocytes isolés se sont différenciés en mo-DC immatures. De plus, tout au long de la différenciation, les mo-DC ont perdu l’expression des marqueurs CD14 et ont gagné l’expression de CD1a et de MHC-II (Figure 1B), qui sont nécessaires à la présentation de l’antigène aux lymphocytes T.

L’isolement et la différenciation des monocytes en mo-DC sont des limites à ce protocole. Le processus d’isolement est une étape sensible qui doit être exécutée avec soin et rapidité pour éviter la mort cellulaire, et cette étape doit également être effectuée chaque fois que des mo-DC sont nécessaires pour une nouvelle expérience. Le processus de différenciation prend 5 à 6 jours, ce qui pose une difficulté en termes d’utilisation de cette méthode pour les analyses à haut débit. Néanmoins, la méthode d’isolement et l’utilisation de cytokines pour différencier les mo-DC sont utiles pour générer un grand nombre de mo-DC fonctionnels in vitro à des fins d’expérimentation. Les mo-DC générés dans ce protocole sont capables de subir un traitement à la sialidase, une cytométrie en flux, un ELISA, une microscopie confocale, etc., soulignant ainsi l’importance et l’utilité de cette méthode30.

Traitement des mo-DC immatures et de la sialidase
Les sialidases sont essentielles à la régulation de la sialylation et sont responsables de l’élimination des acides sialiques des glycanes de surface cellulaire. Dans les mo-DC, l’élimination de l’acide sialique par la sialidase conduit à la maturation de ces cellules, ce qui augmente la présentation croisée de l’antigène et l’activation ultérieure des lymphocytes T et l’activité antitumorale30.

Les mo-DC humaines immatures présentent une teneur élevée en acides sialiques liés à la surface des cellules α(2,6) et α(2,3)27 par rapport aux mo-DC matures31,43. De plus, l’élimination des acides sialiques en traitant les mo-DC avec de la sialidase améliore la maturation des DCs 28,30,31. La sialidase sélectionnée pour cette expérience provenait de la bactérie Clostridium perfringens. Pourtant, d’autres organismes produisent également des sialidases, telles que les bactéries Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae, ou Salmonella typhimurium44, la sangsue Macrobdella decora45, et même Homo sapiens46, et les sialidases de ces organismes sont également utilisées expérimentalement. Cependant, chaque sialidase a des spécificités de substrat différentes. De plus, l’utilisation de l’enzyme sialidase peut avoir ses limites ; par exemple, la manipulation des mo-DC pendant le traitement peut stimuler davantage ces cellules. De plus, la quantité de sialidase et les temps d’incubation doivent être optimisés en fonction du type de cellules utilisées et de leur composition en acide sialique. L’élimination de l’acide sialique n’est pas un effet permanent mais plutôt un phénomène transitoire, car la cellule restaurera sa teneur en acide sialique à la surface de la cellule. Outre la sialidase, il existe d’autres méthodes pour réduire les molécules d’acide sialique à la surface des cellules, telles que l’utilisation d’inhibiteurs de la sialyltransférase, le knock-out des gènes de la sialyltransférase ou le blocage métabolique de l’acide sialique à l’aide de mimétiques de l’acide sialique47,48,49. Néanmoins, ces méthodes peuvent présenter des effets distincts sur les cellules, et outre la désialylation, la viabilité cellulaire doit être prise en compte. Le traitement enzymatique à la sialidase est une méthode pratique pour éliminer efficacement et transitoirement les acides sialiques de surface cellulaire tout en maintenant la viabilité cellulaire.

Dans ce travail, la sialidase a été ajoutée aux mo-DC immatures à la concentration de 500 mU/5 x 106 cellules/mL, et les cellules ont été incubées à 37 °C pendant 60 min. Le traitement a été réalisé à l’aide de RPMI-1640 sans sérum afin de préserver la viabilité cellulaire et d’éviter toute interaction entre les molécules sialylées présentes dans le sérum30. Le traitement par la sialidase peut être effectué avec d’autres tampons que le RPMI, tels que l’acétate de sodium de 50 mM, un pH de 5,1 (dans le cas de C. perfingens sialidase) ou un PBS50,51,52. Néanmoins, le RPMI-1640 est le milieu de culture le plus courant pour les DC car il maintient des conditions expérimentales constantes pendant la procédure, évite d’induire la maturation et réduit tout stress pouvant être causé par les tampons de sialidase ou PBS53,54,55,56. Après l’incubation avec la sialidase, il est essentiel de bien laver les cellules avec un milieu supplémenté en sérum pour garantir l’arrêt de la réaction enzymatique. La présence de molécules sialylées dans le sérum va entrer en compétition en tant que substrats pour la sialidase, assurant ainsi un arrêt rapide de la réaction.

Caractérisation des marqueurs de surface par cytométrie en flux et microscopie confocale
Pour la détermination du profil d’acide sialique, dans la section 3 du protocole, nous avons utilisé la coloration de la lectine suivie d’une cytométrie en flux et d’une microscopie confocale à balayage laser. Pour la procédure de coloration cellulaire, dans les deux cas, les concentrations de lectine et les conditions d’incubation ont été optimisées pour éviter l’agglutination et la mort des cellules. Il est essentiel d’effectuer l’incubation à 4 °C dans des tampons contenant au moins 2 % de FBS ou de BSA pour éviter une liaison non spécifique des lectines. Dans ce protocole, le RPMI-1640 contenant 10 % de FBS a été utilisé pour maintenir des conditions expérimentales constantes et éviter le stress cellulaire. En ce qui concerne la microscopie confocale, la fixation des cellules avant la coloration est essentielle pour préserver la morphologie, prévenir l’autolyse et maintenir l’antigénicité.

L’analyse du phénotype mo-DC par cytométrie en flux a montré que les mo-DC traités à la sialidase avaient une quantité significativement plus élevée de lectine PNA liée à la surface cellulaire par rapport aux lectines MMA et SNA, qui diminuait après le traitement par sialidase (Figure 2A). Comme on pouvait s’y attendre, la coloration du PNA a augmenté, car le PNA reconnaît les antigènes non sialylés, contrairement au MAA et au SNA, qui se lient directement aux acides α2,3- et α2,6-sialique, respectivement30. Cette coloration confirme l’élimination efficace des acides sialiques de la surface cellulaire à l’aide de ce protocole. Une autre méthode qui peut être utilisée pour valider le traitement et analyser la teneur en acide sialique de la surface cellulaire est la coloration de la lectine suivie d’une microscopie confocale, comme illustré à la figure 2B.

Outre les exemples précédents, il existe d’autres approches pour évaluer et caractériser la teneur en acide sialique, telles que le sondage de la lectine par western blot. D’autres lectines spécifiques de l’acide sialique sont également disponibles, telles que les Siglecs, un groupe de lectines qui ont une nette préférence pour les types et les liaisons d’acide sialique57. Outre l’utilisation de lectines dans l’une ou l’autre technique (cytométrie en flux, microscopie ou western blot), il est également possible de caractériser la teneur en acide sialique à l’aide d’anticorps ; Par exemple, les acides α2,8-sialiques peuvent être évalués par des anticorps tels que le clone 735, qui est spécifique de l’acide polysialique58. De plus, après un traitement par la sialidase, les cellules peuvent être testées fonctionnellement pour leur efficacité biologique ou thérapeutique en évaluant leur phénotype et leur capacité à activer les lymphocytes T40. En fait, comme le montrent les exemples fournis, les mo-DC traités à la sialidase ont montré un phénotype de maturation plus élevé, ainsi qu’une expression élevée des molécules présentatrices d’antigènes et co-stimulatrices.

De plus, les mo-DC traités à la saliidase peuvent être chargés d’antigènes et co-cultivés avec des lymphocytes T ou d’autres cellules, puis peuvent être étudiés en fonction du phénotype, du profil de sécrétion de cytokines ou d’autres caractéristiques. Dans l’exemple fourni, les données montrent que les mo-DC traités à la saliidase peuvent être chargés d’antigènes tumoraux, puis utilisés pour activer les lymphocytes T. En fait, les lymphocytes T résultants ont montré une sécrétion accrue d’IFN-γ, ce qui est en accord avec les rapports précédents sur l’effet de la pénurie d’acide sialique sur l’augmentation de la capacité des mo-DC à activer les lymphocytes T 27,28,29,30,31.

En conclusion, ce protocole montre une méthode réalisable, viable et pratique pour générer des mo-DC pour la manipulation de la teneur en acide sialique par traitement par la sialidase. Ce protocole présente une méthodologie qui peut servir différents objectifs et applications. Cette méthode peut non seulement jouer un rôle crucial dans la compréhension du rôle des acides sialiques dans la maturation et la réponse des cellules immunitaires, mais peut également être utilisée comme outil immunomodulateur.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient le financement de l’AG 101079417 de la Commission européenne et de l’EJPRD/0001/2020 EU 825575 ; la Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) Portugal, dans le cadre des subventions FCT 2022.04607.PTDC, UIDP/04378/2020, UIDB/04378/2020 (UCIBIO) et LA/P/0140/2020 (i4HB). FCT-NOVA. et Stemmatters ont également été financés par le Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), par l’intermédiaire du Programa Operacional Regional do Norte (Norte 2020) pour le SI I& Projet DT DCMatters (NORTE-01-0247-FEDER-047212). Nous reconnaissons l’installation de Biolabs à FCT-NOVA et GLYCOVID NOVA Saude.

Materials

15 mL conical tube AstiK’s CTGP-E15-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase
24-well plate Greiner Bio-one 662 160 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase
50 mL conical tube AstiK’s CTGP-E50-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
7-Aminoactinomycin D (7-AAD) BioLegend 420404 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Annexin V Immunotools 31490013 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Attune Acoustic Focusing Flow Cytometer Thermo Fisher Scientific  Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
BSA Sigma – Aldrich A3294-100G Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Determination of Sialic Acid Profile
CD14 (Monoclonal TÜK4) Miltenyi Biotec 130-080-701 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
CD80 Immunotools 21270803 Maturation Profiling of mo-DCs
CD86 Immunotools 21480863 Maturation Profiling of mo-DCs
Cell counting slides and trypan blue EVE EVS-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Centrifuge Eppendorf 5430 R Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Density gradient medium (Histopaque) Sigma – Aldrich 10771-100ML Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
EDTA Gibco, ThermoFisher 15400054 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Elisa kit (IFN-γ) Immunotools 31673539 Maturation Profiling of mo-DCs
EVE automated cell count NanoEntek 10027-452 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10500064 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Miltenyi Biotec   130-093-864 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Human CD14 microbeads (Immunomagnetic beads) Miltenyi Biotec 130-050-201 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-1β Sigma – Aldrich I9401 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-4 Miltenyi Biotec 130-093-919 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-6 Sigma – Aldrich SRP3096 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
L-glutamine Gibco A2916801 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
LS column and plunger Miltenyi Biotec 130-042-401 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Maackia amurensis (MAA) lectin (MAA lectin – Biotinylated) Vector labs B-1265-1 Determination of Sialic Acid Profile
MHC-I (HLA-ABC) Immunotools 21159033 Maturation Profiling of mo-DCs
MHC-II (HLA-DR) Immunostep HLADRA-100T Maturation Profiling of mo-DCs
Microtubes AstiK’s PCRP-E015-500 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Neuraminidase (Sialidase) Roche 11585886001 Treatment of Cells with Sialidase
Non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Paraformaldehyde (PFA 2%) Polysciences Europe 25085-1 Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Paraformaldehyde (PFA 4%) Biotium 22023 Determination of Sialic Acid Profile
Pasteur pipettes Labbox PIPP-003-500 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Peanut (Arachis hypogaea) Agglutinin (PNA) lectin (PNA lectin – FITC) Vector labs FL-1071 Determination of Sialic Acid Profile
Penicillin/streptomycin Gibco 15140163 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Phosphate Buffered Saline (PBS) NZYTech   MB18201 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Prostaglandin E2 (PGE2) Sigma – Aldrich P0409 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
RBC lysis buffer BioLegend 420302 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
RPMI-1640 medium (containing 11.1 mM glucose) Gibco 31870074 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile
Sambucus nigra lectin (SNA lectin – Biotinylated) Vector labs   B-1305-2 Determination of Sialic Acid Profile
Sambucus nigra lectin (SNA lectin – FITC) Vector labs FL-1301-2 Determination of Sialic Acid Profile
Sodium pyruvate Thermofisher 11360-070 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
SpectroMax190 Molecular Devices Maturation Profiling of mo-DCs
Streptavidin-PE BioLegend   405203 Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Tetramethylbenzidine (TMB) Sigma – Aldrich T0440 Maturation Profiling of mo-DCs
Tumour necrosis factor-α (TNF-α) Sigma – Aldrich H8916 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Zeiss LSM710 confocal microscope Zeiss Determination of Sialic Acid Profile
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References

  1. Varki, A., Gagneux, P. Multifarious roles of sialic acids in immunity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1253, 16-36 (2012).
  2. Bochner, B. S., Zimmermann, N. Role of Siglecs and related glycan-binding proteins in immune responses and immunoregulation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 598-608 (2015).
  3. Smith, B. A. H., Bertozzi, C. R. The clinical impact of glycobiology: Targeting selectins, Siglecs and mammalian glycans. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 217-243 (2021).
  4. Schauer, R. Sialic acids as regulators of molecular and cellular interactions. Current Opinion in Structural Biology. 19 (5), 507-514 (2009).
  5. Manhardt, C. T., Punch, P. R., Dougher, C. W. L., Lau, J. T. Y. Extrinsic sialylation is dynamically regulated by systemic triggers in vivo. Journal of Biological Chemistry. 292 (33), 13514-13520 (2017).
  6. Cabral, M. G., et al. Human dendritic cells contain cell surface sialyltransferase activity. Immunology Letters. 131 (1), 89-96 (2010).
  7. Bordron, A., et al. Hyposialylation must be considered to develop future therapies in autoimmune diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3402 (2021).
  8. Julien, S., Videira, P. A., Delannoy, P. Sialyl-Tn in cancer: (How) did we miss the target. Biomolecules. 2 (4), 435-466 (2012).
  9. Munkley, J. Aberrant sialylation in cancer: Therapeutic opportunities. Cancers. 14 (17), 4248 (2022).
  10. Dennis, J. W., Laferte, S., Waghorne, C., Breitman, M. L., Kerbel, R. S. S1-6 Branching of Asn-linked oligosaccharides is directly associated with metastasis. Science. 236 (4801), 582-585 (1987).
  11. Pinho, S. S., Reis, C. A. Glycosylation in cancer: Mechanisms and clinical implications. Nature Reviews Cancer. 15 (9), 540-555 (2015).
  12. Manni, M., Läubli, H. Targeting glyco-immune checkpoints for cancer therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 21 (8), 1063-1071 (2021).
  13. Sjögren, J., Lood, R., Nägeli, A. On enzymatic remodeling of IgG glycosylation; Unique tools with broad applications. Glycobiology. 30 (4), 254-267 (2020).
  14. Trastoy, B., et al. Sculpting therapeutic monoclonal antibody N-glycans using endoglycosidases. Current Opinion in Structural Biology. 72, 248-259 (2022).
  15. Pascoal, C., et al. Sialyl LewisX/A and cytokeratin crosstalk in triple negative breast cancer. Cancers. 15 (3), 731 (2023).
  16. von Itzstein, M., et al. Rational design of potent sialidase-based inhibitors of influenza virus replication. Nature. 363 (6428), 418-423 (1993).
  17. Gray, M. A., et al. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. Nature Chemical Biology. 16 (12), 1376-1384 (2020).
  18. Fernandes, &. #. 1. 9. 4. ;., et al. Glycans as shapers of tumour microenvironment: A sweet driver of T-cell-mediated anti-tumour immune response. Immunology. 168 (2), 217-232 (2023).
  19. Togayachi, A., et al. Polylactosamine on glycoproteins influences basal levels of lymphocyte and macrophage activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15829-15834 (2007).
  20. Park, D. D. Resident and elicited murine macrophages differ in expression of their glycomes and glycan-binding proteins. Cell Chemical Biology. 28 (4), 567-582 (2021).
  21. Steinman, R. M. Dendritic cells and immune-based therapies. Experimental Hematology. 24 (8), 859-862 (1996).
  22. Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2 (1), 37-56 (2010).
  23. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
  24. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
  25. So-Rosillo, R., Small, E. J. Sipuleucel-T (APC8015) for prostate cancer. Expert Review of Anticancer Therapy. 6 (9), 1163-1167 (2006).
  26. Cheever, M. A., Higano, C. S. PROVENGE (Sipuleucel-T) in prostate cancer: The first FDA-approved therapeutic cancer vaccine. Clinical Cancer Research. 17 (11), 3520-3526 (2011).
  27. Videira, P. A., et al. Surface α2-3- and α2-6-sialylation of human monocytes and derived dendritic cells and its influence on endocytosis. Glycoconjugate Journal. 25 (3), 259-268 (2008).
  28. Cabral, M. G., et al. The phagocytic capacity and immunological potency of human dendritic cells is improved by α2,6-sialic acid deficiency. Immunology. 138 (3), 235-245 (2013).
  29. Silva, Z., et al. MHC class I stability is modulated by cell surface sialylation in human dendritic cells. Pharmaceutics. 12 (3), 249 (2020).
  30. Silva, M., et al. Sialic acid removal from dendritic cells improves antigen cross-presentation and boosts anti-tumor immune responses. Oncotarget. 7 (27), 41053-41066 (2016).
  31. Crespo, H. J., et al. Effect of sialic acid loss on dendritic cell maturation. Immunology. 128, 621-631 (2009).
  32. Council of Europe. Guide to the Preparation, Use and Quality Assurance of Blood Components. Council of Europe. , (2017).
  33. LS Columns. Miltenyi Biotec Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/Is-columns.html#130-042-401 (2012)
  34. Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. Isolation and generation of human dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 07, (2012).
  35. Wu, X., Xu, F., Liu, J., Wang, G. Comparative study of dendritic cells matured by using IL-1β, IL-6, TNF-α and prostaglandins E2 for different time span. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (2), 1389-1394 (2017).
  36. Naeim, F., Nagesh Rao, P., Song, S., Phan, R. Chapter 2 – Principles of Immunophenotyping. Atlas of Hematopathology. , 29-56 (2018).
  37. Cernadas, M., Lu, J., Watts, G., Brenner, M. B. CD1a expression defines an interleukin-12 producing population of human dendritic cells. Clinical and Experimental Immunology. 155, 523-533 (2009).
  38. Santambrogio, L., Strominger, J. L. The ins and outs of MHC class II proteins in dendritic cells. Immunity. 25 (6), 857-859 (2006).
  39. Raposo, C. D., Canelas, A. B., Barros, M. T. Human lectins, their carbohydrate affinities and where to find them. Biomolecules. 11 (2), 188 (2021).
  40. Videira, P. A. Q., et al. Patent WO2017002045. A viable cell population, method for production and uses thereof. Portugal patent. , (2017).
  41. Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: Advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. International Journal of Oncology. 20 (2), 247-253 (2002).
  42. Marques, G. S., Silva, Z., Videira, P. A. Antitumor efficacy of human monocyte-derived dendritic cells: Comparing effects of two monocyte isolation methods. Biological Procedures Online. 20, 4 (2018).
  43. Bax, M., et al. Dendritic cell maturation results in pronounced changes in glycan expression affecting recognition by Siglecs and galectins. Journal of Immunology. 179 (12), 8216-8224 (2007).
  44. Chinoy, Z. S., Montembault, E., Moremen, K. W., Royou, A., Friscourt, F. Impacting bacterial sialidase activity by incorporating bioorthogonal chemical reporters onto mammalian cell-surface sialosides. ACS Chemical Biology. 16 (11), 2307-2314 (2021).
  45. Chou, M. -. Y., Li, S. -. C., Li, Y. -. T. Cloning and expression of sialidase L, a NeuAcα2→3Gal-specific sialidase from the leech, Macrobdella decora. Journal of Biological Chemistry. 271 (32), 19219-19224 (1996).
  46. Crespo, H. J., Lau, J. T. Y., Videira, P. A. Dendritic cells: A spot on sialic acid. Frontiers in Immunology. 4, 491 (2013).
  47. Büll, C. Metabolic sialic acid blockade lowers the activation threshold of moDCs for TLR stimulation. Immunology & Cell Biology. 95 (4), 408-415 (2017).
  48. Ohmi, Y., et al. Majority of alpha2,6-sialylated glycans in the adult mouse brain exist in O -glycans: SALSA-MS analysis for knockout mice of alpha2,6-sialyltransferase genes. Glycobiology. 31 (5), 557-570 (2021).
  49. Chung, C., et al. Integrated genome and protein editing swaps α-2,6 sialylation for α-2,3 sialic acid on recombinant antibodies from CHO. Biotechnology Journal. 12 (2), 1600502 (2017).
  50. Hyvärinen, S., Meri, S., Jokiranta, T. S. Disturbed sialic acid recognition on endothelial cells and platelets in complement attack causes atypical hemolytic uremic syndrome. Blood. 127 (22), 2701-2710 (2016).
  51. Powell, L. D., Whiteheart, S. W., Hart, G. W. Cell surface sialic acid influences tumor cell recognition in the mixed lymphocyte reaction. Journal of Immunology. 139, 262-270 (1987).
  52. Corfield, A. P., Higa, H., Paulson, J. C., Schauer, R. The specificity of viral and bacterial sialidases for α(2-3)- and α(2-6)-linked sialic acids in glycoproteins. Biochimica et Biophysica Acta – Protein Structure and Molecular Enzymology. 744 (2), 121-126 (1983).
  53. Tkachenko, N., Wojas, K., Tabarkiewicz, J., Rolinski, J. Generation of dendritic cells from human peripheral blood monocytes – Comparison of different culture media. Folia Histochemica et Cytobiologica. 43, 25-30 (2005).
  54. Kim, S. J., et al. Human CD141+ dendritic cells generated from adult peripheral blood monocytes. Cytotherapy. 21 (10), 1049-1063 (2019).
  55. Calmeiro, J., et al. In-depth analysis of the impact of different serum-free media on the production of clinical grade dendritic cells for cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology. 11, 593363 (2021).
  56. Stamatos, N. M., et al. LPS-induced cytokine production in human dendritic cells is regulated by sialidase activity. Journal of Leukocyte Biology. 88 (6), 1227-1239 (2010).
  57. Lehmann, F., Tiralongo, E., Tiralongo, J. Sialic acid-specific lectins: Occurrence, specificity and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1331-1354 (2006).
  58. Frosch, M., Görgen, I., Boulnois, G. J., Timmis, K. N., Bitter-Suermann, D. NZB mouse system for production of monoclonal antibodies to weak bacterial antigens: Isolation of an IgG antibody to the polysaccharide capsules of Escherichia coli K1 and group B meningococci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (4), 1194-1198 (1985).

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Luz, V. C. C., Silva, Z., Sobral, P., Tanwar, A., Paterson, R. L., Videira, P. A. Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes. J. Vis. Exp. (200), e65525, doi:10.3791/65525 (2023).
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