Nachweis von Tollwut-IgG- und IgM-Antikörpern mit dem Tollwut-Test mit indirekten fluoreszierenden Tollwut-Antikörpern
Summary
Ziel dieses Manuskripts ist es, den Einsatz des indirekten Fluoreszenz-Antikörpertests für Tollwut zum Nachweis von tollwutspezifischen IgG- und IgM-Antikörpern zu untersuchen.
Abstract
Der Tollwut-Test mit indirekten fluoreszierenden Antikörpern (IFA) wurde entwickelt, um verschiedene tollwutspezifische Antikörper-Isotypen in Seren oder Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit nachzuweisen. Dieser Test liefert schnelle Ergebnisse und kann zum Nachweis von Tollwut-Antikörpern in verschiedenen Szenarien verwendet werden. Der Tollwut-IFA-Test ist besonders nützlich für den schnellen und frühen Nachweis von Antikörpern, um die Immunantwort bei einem Patienten, der an Tollwut erkrankt ist, zu bewerten. Obwohl andere Methoden zur antemortalen Tollwutdiagnostik Vorrang haben, kann dieser Test verwendet werden, um eine kürzliche Exposition gegenüber dem Tollwutvirus durch Antikörpernachweis nachzuweisen. Der IFA-Test liefert keinen virusneutralisierenden Antikörpertiter (VNA), aber die Reaktion auf die Präexpositionsprophylaxe (PrEP) kann durch positives oder negatives Antikörpervorhandensein bewertet werden. Dieser Test kann in verschiedenen Situationen eingesetzt werden und Ergebnisse für eine Reihe verschiedener Ziele liefern. In dieser Studie verwendeten wir mehrere gepaarte Serumproben von Personen, die PrEP erhielten und ihre Tollwut-Antikörperpräsenz im Laufe der Zeit mit dem IFA-Test nachweisen konnten.
Introduction
Der Tollwut-Test mit indirekten fluoreszierenden Antikörpern (IFA) dient zum Nachweis verschiedener tollwutspezifischer Antikörper-Isotypen in Seren oder im Hirn-Rückenmarks-Flüssigkeit. Er gehört zu einem Arsenal von Tests, die für die Überwachung eines antemortalen Tollwutpatienten zur Verfügung stehen. Es ist besonders nützlich für die Früherkennung von Antikörpern, um die Immunantwort eines Patienten auf eine Tollwutinfektion zu bewerten. In Verbindung mit anderen Tests, der Anamnese und dem Impfstatus des Patienten kann der IFA-Test bei der Bestimmung der Exposition gegenüber dem Tollwutvirus oder einem Impfstoff helfen1. Da der IFA-Test IgM und/oder IgG misst, können die Werte des spezifischen Antikörpers einen ungefähren Zeitrahmen von der Exposition gegenüber dem Antigen1 anzeigen. Dieser Test kann in den aufgeführten Anwendungen oder anderen, die noch nicht untersucht wurden, nützlich sein.
Es stehen mehrere serologische Tollwuttests zur Verfügung. Der Fluoreszenz-Fokus-Inhibitions-Schnelltest (RFFIT), der Fluoreszenz-Antikörper-Virus-Neutralisationstest (FAVN) oder deren Modifikationen sind die primären Methoden zur Messung von Tollwutvirus-neutralisierenden Antikörpern (RVNAs)1. Diese Tests unterscheiden jedoch nicht zwischen IgM- und IgG-Antikörpern. Wenn die Differenzierung des Antikörper-Isotyps für die Überwachung der Tollwut-Immunantwort wichtig ist, werden die Tollwut-IFA- und die Tollwut-ELISA-Tests (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) verwendet, die jedoch keine RVNAs messen. Obwohl die IFA- und ELISA-Tests verwendet werden können, um das Vorhandensein von tollwutspezifischen Antikörpern in einer Probe zu bestimmen, gibt es einige Unterschiede in der Art und Weise, wie sie durchgeführt werden. Der IFA-Test verwendet ein zellkultiviertes lebendes Virus als Antigensubstrat, während ein typischer ELISA für den Tollwutnachweis eines oder mehrere der viralen Proteine verwendet. In einer Laborumgebung, in der das Tollwutvirus kultiviert werden kann, kann der IFA-Test einfacher durchgeführt werden, anstatt einzelne virale Proteine für den ELISA zu kaufen oder zu kultivieren. Der Zweck der Untersuchung und die Informationen, die aus den Ergebnissen eines serologischen Tollwuttests gewonnen werden, sollten bei der Entscheidung berücksichtigt werden, welche zu wählenist 2.
IgM reagiert zuerst und steigt an, bis etwa am 28. Tag ein Klassenwechsel beobachtet wird, an dem IgG zum vorherrschenden zirkulierenden Antikörperwird 3. Daher wäre IgM nur für einen begrenzten Zeitraum nach der Exposition gegenüber dem Tollwutvirus oder einer Impfung zu erwarten. Die Untersuchung von Serum und Liquor cerebrospinalis (CSF) kann darauf hinweisen, ob die Exposition durch eine Impfung erfolgte, bei der Antikörper nur in Seren zu sehen sind, oder durch eine Virusinfektion, die möglicherweise Antikörper im Liquor1 aufweisen würde.
Es wurde festgestellt, dass Tollwut-Antikörper nach einer Präexpositionsprophylaxe (PrEP) mehrere Jahre persistieren4. Der IFA-Test kann ein nützliches Instrument sein, um dies zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Impfung oder Exposition nachzuweisen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der IFA-Test nutzt einen Antigen-Antikörper-Komplex, der eine Markierungsstelle zur Visualisierung tollwutspezifischer Antikörper ermöglicht. Neuroblastom- oder BHK-Zellen werden auf PTFE-beschichtete Objektträger mit mehreren Wells gesetzt und mit dem Tollwutvirus-Laborstamm CVS-11 inokuliert. Sobald die Monoschicht konfluiert ist und die Zellen die gewünschte Infektiosität von ca. 50 % erreicht haben, werden die Objektträger bis zur Gebrauchsbereitschaft gelagert6.
<p class="jove_cont…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Wadsworth Center des New York State Department of Health für die Unterstützung dieses Projekts.
Materials
| 25x55mm glass cover slips | Any | ||
| Acetone | Any | ||
| Anti-Human IgG Labeled Conjugate | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Anti-Human IgM Labeled Conjugate | SeraCare | 5230-0286 | |
| Aspirating pipette tip | Any | ||
| BHK-21 Cells | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Diluent | MBL BION | DIL-9993 | |
| Cell Culture water | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin Jars | Any | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| Fluorescent microscope with FITC filter | Any | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | Mountant |
| Gullsorb IgM inactivation reagent | Fisher Scientific | 23-043-158 | IgG Inactivation Reagent |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Mouse Neuroblastoma Cells | ATCC | CCL-131 | |
| Multi-well Teflon coating glass slides | Any | ||
| PBS | Any | pH 7.6 | |
| Penicillin | Sigma | P-3032 | EGM |
| Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate | Millipore Sigma | 5100, 5500 or 6500 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Sodium Chloride crystals | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Sterile dropper | Any | ||
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma pre-set crystals pH 9.0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mountant |
| Tryptose Phosphate Broth | BD | 260300 | EGM |
| Vitamin mix | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
References
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , 232-245 (2018).
- Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516 (2021).
- Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
- Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
- Fooks, A. R., Jackson, A. C. . Rabies: scientific basis of the disease and its management. , (2020).
- Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
- Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
- Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
- Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595 (2010).
