Summary

Farelerde Serbest El İntraserebroventriküler Enjeksiyonlar

Published: January 12, 2024
doi:

Summary

Burada, farelerde serbest el yaklaşımı kullanarak (yani stereotaksik bir cihaz olmadan) intraserebroventriküler enjeksiyonlar yapmak için basit ve hızlı bir yaklaşım açıklanmaktadır.

Abstract

Nöroendokrin sistemlerin araştırılması genellikle ilaçların, virüslerin veya diğer deneysel ajanların doğrudan farelerin beyinlerine verilmesini gerektirir. İntraserebroventriküler (ICV) enjeksiyon, deneysel ajanın beyin boyunca (özellikle ventriküllerin yakınındaki yapılarda) yaygın olarak verilmesine izin verir. Burada, yetişkin farelerde serbest el ICV enjeksiyonları yapma yöntemleri açıklanmaktadır. Farelerin kafalarındaki görsel ve dokunsal işaretler kullanılarak, lateral ventriküllere enjeksiyonlar hızlı ve güvenilir bir şekilde yapılabilir. Enjeksiyonlar, deneycinin elinde tutulan bir cam şırınga ile yapılır ve yer işaretlerinden yaklaşık mesafelere yerleştirilir. Bu nedenle, bu teknik stereotaksik bir çerçeve gerektirmez. Ayrıca, bu teknik, uyanık, serbestçe davranan farelerde fare davranışının ve / veya fizyolojisinin daha sonra değerlendirilmesine izin veren sadece kısa izofluran anestezisi gerektirir. Serbest el ICV enjeksiyonu, deneysel ajanların canlı farelerin beyinlerine verimli bir şekilde verilmesi için güçlü bir araçtır ve nöroendokrin süreçleri araştırmak için sık kan örneklemesi, nöral devre manipülasyonu veya in vivo kayıt gibi diğer tekniklerle birleştirilebilir.

Introduction

İlaç1, virüs2 veya hücre3 gibi deneysel ajanların beyne verilmesi genellikle nöroendokrin araştırmalar için gereklidir. Ajan kan-beyin bariyerini kolayca geçmiyorsa veya deneysel amaç, ajanın merkezi etkilerini spesifik olarak test etmekse, beyne enjeksiyon yapmak için güvenilir bir yönteme sahip olmak önemlidir. Ayrıca intraserebroventriküler (ICV) boşluğa enjeksiyon, ajanın beyinde geniş bir alana yayılmasına olanak sağlar ve geniş bir hedef alan sağlar, böylece başarılı enjeksiyon olasılığını artırır2.

ICV enjeksiyonları yapmak için yaygın bir yöntem, kalıcı bir kalıcı kanülün yerleştirilmesini içerir. Bu yaklaşımda, kanül yerine yapıştırıldığı veya yapıştırıldığı için ticari olarak temin edilebilen veya ısmarlama kanülü konumlandırmak için stereotaksik bir çerçeve gereklidir. Genellikle, iyileşmeden sonra, kanül yoluyla suprafizyolojik bir anjiyotensin II dozu uygulanır ve içme davranışı hemen gözlenirse, kanülün doğru yerleştirildiği kabul edilir4. Bu yaklaşımın, uzun süreli infüzyon gerçekleştirme yeteneği ve aynı hayvanı birden çok kez enjekte etme yeteneği dahil olmak üzere birçok avantajı vardır; Ek olarak, anjiyotensin II kullanılırsa, deneysel bileşiklerin uygulanmasından önce doğru yerleştirme doğrulanabilir. Bununla birlikte, pahalı ekipman gereksinimi (stereotaksik çerçeve), yerleştirmeden sonra kanülün hasar görme olasılığı (örneğin, fareler bir kafes arkadaşının kanülünü çiğneyebilir) ve kalıcı kanül çevresinde enfeksiyon olasılığı dahil olmak üzere kalıcı bir kanül yerleştirmenin bazı sınırlamaları vardır. Tek ICV enjeksiyonları, etkili olmasına rağmen, anesteziye önemli ölçüde maruz kalmayı gerektiren ve bu nedenle tedavinin bazı akut fizyolojik ve davranışsal etkilerini gizleyebilen bir stereotaksik çerçeve3 kullanılarak yapılabilir. Ek olarak, farelerin stereotaksik bir çerçeveye yerleştirilmesi, sabit bir yerleştirme elde etmek ve kulak kanallarının yırtılmasını önlemek için önemli bir eğitim gerektirir.

Burada, farelerde serbest el enjeksiyonları yapmak için yerleşik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem önceki raporlaradayanmaktadır 5,6. Bu tekniğin avantajları, basit, hızlı olması ve stereotaksik çerçeve gibi özel ekipman gerektirmemesidir. Aşağıda tarif edildiği gibi, bu prosedür, hızlı bir şekilde yapılabilen ve bu nedenle deney gününde sadece birkaç dakikalık gaz anestezisi gerektiren enjeksiyonları yapmak için fare kafasındaki yer işaretlerine göre bir cam şırınganın manipüle edilmesini içerir.

Protocol

Tüm prosedürler, temsili verilerin toplandığı Colorado Eyalet Üniversitesi (# 3960) ve California Üniversitesi San Diego Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komiteleri tarafından onaylandı (S13235, PI Kellie Breen Kilisesi). Beş yetişkin dişi ve iki yetişkin erkek C57/BL6 faresinden (9-16 haftalık) elde edilen veriler temsili veriler bölümünde gösterilmektedir. Dişi fareler, daha önce tarif edildiği gibi ICV enjeksiyonu ve kan alımından 3-4 hafta önce yumurtalıkta kaldı7</s…

Representative Results

Başarılı bir şekilde gerçekleştirildiğinde, bu teknik, deneysel bir ajanın ventriküler sisteme hızlı bir şekilde verilmesine izin verir. Birçok farmakolojik bileşiğin aracı olan 3 μL steril izotonik salin ICV enjeksiyonu alan yumurtalıklı bir fareden alınan luteinize edici hormon (LH) nabız profili Şekil 2A’da gösterilmektedir. Bu örnek, gaz anestezisine kısa süre maruz kalmanın ve ventriküler sisteme 3 μL sıvı enjeksiyonunun tek başına pulsatil LH sekresyonu…

Discussion

Burada, farelerde ICV enjeksiyonları yapmak için basit ve etkili bir araç açıklanmaktadır. Bu teknik stereotaksik bir çerçeve gerektirmediğinden, ilaçların ve deneysel ajanların merkezi olarak verilmesi için bu yaklaşım daha fazla araştırmacı tarafından erişilebilir. Ek olarak, hazırlama ve enjeksiyon prosedürü hızlı bir şekilde gerçekleştirilebildiğinden bu yaklaşım nispeten yüksek verimdir.

Bu prosedür, iğnelerin ve bir cam şırınganın yaklaşık mesafele…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Kellie Breen Church, Bay Michael Kreisman ve Bayan Jessica Jang’a temsili sonuçlarda gösterilen verilerin toplanmasına katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R00 HD104994 (RBM) tarafından desteklenmiştir.

Materials

18-gauge blunt needles SAI Infusion B18-150
18-gauge needles BD Medical 305195
Alcohol pads Fisher Scientific 22-363-750
Bench pad Fisher Scientific 14-206-62AC22
Betadine solution Fisher Scientific NC1696484
Buprenorphine Patterson Vet Supply 07-892-5235 Controlled substance
Eyelube Fisher Scientific 50-218-8442
Glass syringe Hamilton 7634-01
Injection needle Hamilton 7803-01 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45
Isoflurane   Patterson Vet Supply 07-893-8441
Isoflurane vaporizer Vet Equip V-10
Laboratory Tape VWR 89098-128
Medical grade oxygen Airgas OX USPEA
Paraformaldehyde Millipore-Sigma 8.18715.1000
Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific J67802.K2
PulsaR Software Open source, University of Otago See ref 9
Ruler Fisher Scientific 12-00-152
Silastic tubing (0.040" I.D.) DOW 508-005
Silastic tubing (0.078" I.D.) DOW 508-009
Sterile saline VWR 101320-574
Sucrose  Fisher Scientific S5-500

References

  1. Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
  2. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
  3. Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
  4. Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
  5. Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
  6. Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
  7. McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
  8. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
  9. Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
  10. Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
  11. Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin’s central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
  12. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  13. Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).

Play Video

Cite This Article
McCosh, R. B., Young, L. A. Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice. J. Vis. Exp. (203), e65324, doi:10.3791/65324 (2024).

View Video