Внутримозговые инъекции в свободную руку у мышей
Summary
Здесь описан простой и быстрый подход к выполнению внутримозговых инъекций мышам с использованием свободного доступа (то есть без стереотаксического устройства).
Abstract
Исследование нейроэндокринной системы часто требует доставки лекарств, вирусов или других экспериментальных агентов непосредственно в мозг мышей. Внутримозговая инъекция (ИЦВ) позволяет широко распространять экспериментальный агент по всему мозгу (особенно в структурах вблизи желудочков). В данной статье описаны методы проведения инъекций ICV в свободной руке у взрослых мышей. Используя визуальные и тактильные ориентиры на головах мышей, инъекции в боковые желудочки можно делать быстро и надежно. Инъекции делаются стеклянным шприцем, который экспериментатор держит в руке и размещает на приблизительном расстоянии от ориентиров. Таким образом, данная методика не требует стереотаксического кадра. Кроме того, этот метод требует только кратковременной анестезии изофлураном, что позволяет впоследствии оценить поведение и/или физиологию мышей у бодрствующих, свободно ведущих себя мышей. Инъекция ICV в свободную руку является мощным инструментом для эффективной доставки экспериментальных агентов в мозг живых мышей и может сочетаться с другими методами, такими как частый забор крови, манипуляции с нейронными цепями или запись in vivo для исследования нейроэндокринных процессов.
Introduction
Доставка экспериментальных агентов, таких как лекарства1, вирусы2 или клетки3, в мозг часто необходима для нейроэндокринных исследований. Если агент не может легко проникнуть через гематоэнцефалический барьер или цель эксперимента состоит в том, чтобы специально проверить центральные эффекты препарата, важно иметь надежный метод доставки инъекций в мозг. Кроме того, инъекция в внутримозговое (ВЦВ) пространство дает возможность широко распределить агент в головном мозге и обеспечивает большую целевую область, тем самым повышая вероятность успешной инъекции2.
Распространенный метод проведения инъекций ICV включает в себя установку постоянной внутренней канюли. При таком подходе стереотаксическая рама необходима для позиционирования имеющейся в продаже или изготовленной на заказ канюли, так как канюля приклеена или зацементирована на месте. Часто при выздоровлении через канюлю вводят супрафизиологическую дозу ангиотензина II, и если сразу наблюдается питьевое поведение, то канюля считается правильно поставленной4. Такой подход имеет множество преимуществ, в том числе возможность проведения длительной инфузии и возможность многократного введения одному и тому же животному; Кроме того, если используется ангиотензин II, правильное размещение может быть подтверждено до введения экспериментальных соединений. Тем не менее, существуют некоторые ограничения для установки постоянной канюли, в том числе необходимость дорогостоящего оборудования (стереотаксическая рама), возможность повреждения канюли после установки (например, мыши могут жевать канюлю соседа по клетке) и возможность инфекций вокруг постоянной канюли. Однократные инъекции ICV могут быть сделаны с использованием стереотаксического фрейма3, который, хотя и эффективен, требует значительного воздействия анестезии и, таким образом, может скрывать некоторые острые физиологические и поведенческие эффекты лечения. Кроме того, помещение мышей в стереотаксическую рамку требует существенной подготовки для достижения стабильного положения и предотвращения разрыва слуховых проходов.
Здесь описан устоявшийся метод проведения инъекций свободной рукой у мышей. Этот метод основан на предыдущих отчетах 5,6. Преимущества этой методики в том, что она проста, быстра и не требует специализированного оборудования, такого как стереотаксическая рамка. Как описано ниже, эта процедура включает в себя манипуляции со стеклянным шприцем относительно ориентиров на голове мыши для выполнения инъекций, которые могут быть сделаны быстро и, таким образом, требуют всего нескольких минут газовой анестезии в день эксперимента.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь описано простое и эффективное средство для проведения инъекций ICV мышам. Поскольку этот метод не требует стереотаксической рамки, такой подход к централизованной доставке лекарств и экспериментальных агентов доступен большему количеству исследователей. Кроме того, этот подход …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Келли Брин Черч, г-на Майкла Крайсмана и г-жу Джессику Янг за их вклад в сбор данных, представленных в репрезентативных результатах. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.).
Materials
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
References
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin’s central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
