プラズモニックDNAオリガミナノアンテナによる1分子表面増強ラマン散乱測定

1. DNAオリガミフォークアセンブリ DNAオリガミ構造をワンポットで自己組織化します。まず、15 mM MgCl 2バッファーを添加した1x TAE(トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン[トリス]、酢酸、エチレンジアミン酢酸[EDTA])に、2.5 nMの円形足場鎖M13mp18(7,249ヌクレオチド、材料表を参照)と100 nMの201個の短いオリゴヌクレオチド(表1)を追加します。その後、超純水を用いて全量を100μLに調整します。 続いてサーモサイクラーで温度勾配によって溶液をアニールし、最初に80°Cに急速に加熱し、次に1°C/12分で80°Cから20°Cに冷却し、次に1°C/6分で20°Cから16°Cに冷却し、続いて16°Cから8°Cに急速に冷却する。 100 kDa分子量カットオフ(MWCO)アミコンフィルター( 材料表を参照)を使用して、余分なステープルから混合物を精製します。DNAオリガミ溶液100 μLをアミコンフィルターに加え、超純水400 μLを加え、6,000 x g で室温(RT)で8分間遠心分離します。 フィルターを取り外し、チューブを裏返してシンクのウォッシュアウトを取り除き、フィルターに400μLの超純水を加えて再度遠心分離してろ液を廃棄します。この手順をもう一度繰り返します。 精製されたナノ構造溶液を回収するには、新しいチューブでフィルターを逆さまにして、製造元の指示に従って遠心分離機(1,000 x g、2分、RT)します( 材料表を参照)。この溶液は、8°Cの冷蔵庫で最大2週間保存できます。注:アミコンフィルター精製ステップでは、安定性が低下し、得られるDNA折り紙フォークの濃度が低下するため、超純水の代わりに1x TAEバッファーまたは1x TAEに15 mM MgCl2 バッファーを添加したものを使用してください。単一色素分子測定の場合、DNAステープル鎖混合物は、5’末端にTAMRA色素を含む修飾鎖混合物に置き換えられます。この修飾された鎖は、ナノフォークブリッジの中央にあります(表2)。 2.金ナノ粒子(AuNP)コーティング 注:Liuら23プロトコルの修正版を使用してAuNPをコーティングし、コーティングプロセスにはAuNP-DNA溶液の凍結が含まれていました。 遠心分離機(3,500 x g、5分、RT)400 μLの直径60 nmのAuNP溶液(市販品; 材料表参照)を加え、ピペットを用いて、上清を除去した。その後、ペレットを25μLの超純水に再可溶化します。AuNPの最終濃度は~0.3 nMです。 100 mM トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)溶液1 μLをチオール修飾DNA(製造元提供の100 μM、 材料表参照)に添加し、RTで10分間インキュベートします。 インキュベーション後、5 μLの混合物を濃縮AuNP溶液に加え(ステップ2.1)、5秒間ボルテックスし、-20°Cで少なくとも2時間凍結します。 RTで解凍した後、混合物を遠心分離機(3,500 x g、5分、RT)で、過剰に添加したコーティングDNAを除去した。ピペットを用いて上清を除去し、ペレットを10 μLの水に再溶解します。注:ナノフォーク上の各AuNPには2つのコーティングストランドがあります(表2)。ステップは、DNAコーティング鎖の配列を除いて同じである。粒子がコーティングされると、それらは非常に安定しています。彼らは冷蔵庫に何ヶ月もそのままとどまることができ、冷凍することさえできます。完全にコーティングされた色素AuNPの場合、コーティングDNA鎖は内部にTAMRA色素を有する。 3. ドナアセンブリ コーティングされたAuNP溶液をナノフォーク溶液に、濃度モル比1.5:1で加えます。 50 mM MgCl2 ストック溶液を使用して、MgCl2を終濃度 4 mM まで添加します。超純水を使用して最終容量を20μLに調整します。 サーモサイクラー内の温度勾配を用いてDONAをハイブリダイズする。まず、40°Cまで急速に加熱し、次に1°C / 10分で40°Cから20°Cまで冷却し、次に20°Cから8°Cまで急速に冷却します。 4. ゲル電気泳動 注:DONA溶液中の未結合ナノ粒子は、アガロースゲル電気泳動によって除去されます。 1%アガロースゲルを調製する。このために、0.8 gのアガロースを5 mM MgCl2を添加した80 mLの1x TAEに溶解します。 2.25 μLのローディングバッファー(30%グリセロール、13 mM MgCl 2、材料の表を参照)を18 μLのDONA溶液に加え、ステップ3.2の4 mMから5 mM MgCl2の最終濃度に到達します。また、ローディングバッファーは、サンプルがゲルのポケット内に留まることを保証します。 ゲルを氷水浴中で70 Vで60分間流します。ランニングバッファーは、5 mM MgCl 2 を添加した 1x TAE です。 目的のバンドを切り取り、パラフィンプラスチックフィルムで包んだ顕微鏡スライドに置き、次に2番目のパラフィンプラスチックフィルムで包まれた顕微鏡スライドを使用して溶液を絞り出します。ピペットを使用して、圧搾した液体を500 μLのチューブに集めます。 5. AFMとラマン測定の共局在化 シリコンチップ( 材料表を参照)を10分間プラズマ処理した後、10 μLの精製DONA溶液と10 μLの100 mM MgCl2 をチップ上で3時間インキュベートします。次に、エタノールと水の1:1混合物(体積比)でチップを2回洗浄し、圧縮空気でブロードライします。次に、チップを磁気ディスクにテープで留め、イメージングのために機器に挿入します。注意: 測定を開始する前に、ラマン励起レーザーの位置がAFMプローブチップの上になるように調整します。本研究では、HORIBA LabRAM HR Evolution ラマン顕微鏡と HORIBA オメガスコープ AFM を併用した。機器は、ソフトウェアLabSpecとAISTを使用して制御されます。 AFM測定には、タッピングモード(ACモード)とACCESS-NC-A(共振周波数:300kHz、スプリング定数:45N/m)チップ24を使用してください。ACモードは、1Hzに設定されたスキャンレートを除くすべてのパラメータを自動的に制御します。注意: AFMイメージングに続いて、AFMチップはラマンレーザーの経路にないように引き出されます。これは、システムにプログラムされたマクロ機能「プローブアウェイ」を使用して行われます。このようにして、AFM画像内の任意の選択されたポイントについて、レーザーはAFMと比較してオフセットなしで同じ位置になります。 これらのパラメータはすべて測定サンプルに依存するため、ラマン測定に必要なレーザー波長、出力、および蓄積時間を選択してください。完全にコーティングされたTAMRA AuNP測定には、前述のパラメータ(633 nmレーザー、100 μW出力、および1秒の積分時間)を使用してください。 1回のTAMRA測定には、633 nmレーザー、400 μWの出力、4秒の積分時間など、前述のパラメータを使用してください。 パラメータを調整した後、AFM画像内の目的のDONAの上にカーソルを置きます。ソフトウェアの「カーソルの移動」機能はこれを行います。その後、ラマン測定を開始する。注:スペクトルを取得するためのさまざまなモードがあります:単一ポイント測定-1次元時間マッピング-単一ポイントが時間25にわたって測定されます。2次元XYエリアマッピングであって、電動ステージがレーザの下を移動して、XYグリッド26内の点のアレイからスペクトルを取得する。