網膜神経節細胞の研究のためのメタノールベースのホールマウント調製

網膜神経節細胞(RGC)は網膜内の唯一の投射ニューロンであり、外部の視覚情報を統合して脳に伝達します¹。緑内障や外傷性視神経障害などの多くの神経変性疾患は、不可逆的な損傷とRGCの喪失を特徴としています^2,3。RGCの形態学的および量的変化を分析することは、神経変性疾患がどのように発症し進行するかを決定する上で重要なステップです^4,5。

間接免疫蛍光アッセイは、タンパク質の分布と細胞カウントをモニターするために広く受け入れられている方法です。実験室では、^網膜の生理学的および病理学的状態を評価するために、RGCの実験的研究で全マウント網膜免疫染色が一般的に使用されています6。網膜全体でRGC定量に使用される最も一般的なマーカーには、Brn3a、多重スプライシングを伴うRNA結合タンパク質(RBPMS)などがあります^7,8。RGCの量と分布を特徴付けるには、高品質の全マウント網膜免疫染色が必要です。一般に、免疫染色プロトコルでは、網膜は抗体でインキュベートされる前に化学固定液に浸されます。理想的な固定剤は、細胞の形状、抗体に対するエピトープの接近性または親和性、^{または組織の直線}寸法を変えるべきではない9^、10。

網膜の構造が複雑なため、網膜膜の損傷や折り畳みなどの問題や、細胞の収縮や核の不明瞭さなどの一般的な問題が発生しやすく、実験研究に悪影響を及ぼします。さらに、すべての網膜がすぐに免疫染色されるわけではなく、特に貴重な起源の高価な価格のトランスジェニックマウスの網膜に関しては、さらなる使用のために余分な網膜サンプルを保存する必要があります。

適切な固定液は、組織を迅速に固定し、組織の自己消化を回避し、組織細胞の正常な形態と構造を維持し、タンパク質やその他の物質の抗原性を維持することができます¹⁰。現在、ホルムアルデヒドベースの固定は、分離された網膜、半切除されたアイカップ、および眼球全体を含む様々な組織において広く使用されている¹⁰。組織の収縮と細胞の形態学的変化は、ホルムアルデヒド¹¹に浸した後に直面する2つの重要な課題です。加えて、網膜および標的細胞の本来の特性の保持を最大化するために、修正された固定製剤がますます出現している^9、10。異なる網膜固定治療は、網膜構造、タンパク質免疫原性、蛍光励起、および減弱消光サイクルに異なる影響を与える可能性があります^12,13。デビッドソンの溶液で固定された網膜は、ホルマリンで固定されたものと比較して形態学的に無傷ですが、デビッドソンの溶液は、ミクログリアマーカーイオン化カルシウム結合アダプター分子1¹²などの一部の抗体との適合性が低くなります。網膜の脆弱な性質を考えると、研究者は当然、網膜の完全性、ならびに標的細胞の特性と形態が長期保存後に変化するかどうか疑問に思うでしょう。しかし、数ヶ月保存後の網膜およびRGC細胞の形態に対する固定液の影響の可能性はほとんど報告されていません。網膜固定の最適化は、RGCの評価と保存に不可欠です。

全マウントマウス網膜染色に使用する信頼性が高く技術的に簡単な方法の詳細な説明を提供します。私たちの方法は、網膜組織の長期保存の必要性と蛍光色素の形成または分解の特定の側面を考慮して、RGC調査のための網膜の適切な調製と保存を強調しています。