PRÉPARATION À MONTAGE ENTIER À BASE DE MÉTHANOL POUR L’ÉTUDE DES CELLULES GANGLIONNAIRES DE LA RÉTINE
Summary
Le méthanol peut être utilisé comme milieu fixe auxiliaire pour les préparations rétiniennes à montage entier et le stockage à long terme, ce qui est utile pour l’investigation des cellules ganglionnaires de la rétine.
Abstract
Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), qui sont les neurones de projection de la rétine, propagent des informations visuelles externes au cerveau. Les changements pathologiques dans les RGC ont une relation étroite avec de nombreuses maladies dégénératives de la rétine. L’immunomarquage rétinien à montage entier est fréquemment utilisé dans les études expérimentales sur les CGR pour évaluer les conditions développementales et pathologiques de la rétine. Dans certaines circonstances, certains échantillons précieux de rétine, tels que ceux provenant de souris transgéniques, peuvent devoir être conservés pendant une longue période sans affecter la morphologie ou le nombre de CGR. Pour des résultats expérimentaux crédibles et reproductibles, l’utilisation d’un milieu de conservation efficace est essentielle. Ici, nous décrivons l’effet du méthanol en tant que milieu fixe auxiliaire pour les préparations rétiniennes à montage entier et le stockage à long terme. En bref, pendant le processus d’isolement, du méthanol froid (-20 °C) est pipeté à la surface de la rétine pour aider à fixer les tissus et faciliter leur perméabilité, puis les rétines peuvent être stockées dans du méthanol froid (-20 °C) avant d’être immunocolorées. Ce protocole décrit le flux de travail d’isolement de la rétine et le protocole de stockage des échantillons de tissus, ce qui est utile et pratique pour l’étude des CGR.
Introduction
Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) sont les seuls neurones de projection dans la rétine, et elles intègrent et transmettent des informations visuelles extérieures au cerveau1. De nombreuses maladies neurodégénératives telles que le glaucome et la neuropathie optique traumatique sont caractérisées par des dommages irréversibles et la perte deCGR2,3. L’analyse des changements morphologiques et quantitatifs des CGR est une étape cruciale pour déterminer comment les maladies neurodégénératives se développent et progressent 4,5.
Le test d’immunofluorescence indirecte est une méthode largement acceptée pour surveiller la distribution des protéines et le comptage cellulaire. En laboratoire, l’immunomarquage rétinien à montage entier est couramment utilisé dans les études expérimentales sur les CGR pour évaluer les conditions physiologiques et pathologiques de la rétine6. Les marqueurs les plus couramment utilisés pour la quantification du RGC dans l’ensemble de la rétine comprennent Brn3a, protéine de liaison à l’ARN avec épissage multiple (RBPMS), et ainsi de suite 7,8. La caractérisation de la quantité et de la distribution des CGR nécessite une immunocoloration rétinienne de haute qualité à montage entier. Généralement, dans les protocoles d’immunomarquage, la rétine est immergée dans des fixateurs chimiques avant d’être incubée dans des anticorps. Les fixateurs idéaux ne doivent pas modifier la forme des cellules, l’accessibilité ou l’affinité des épitopes pour les anticorps, ni les dimensions linéaires du tissu 9,10.
En raison de la structure complexe de la rétine, des problèmes tels que la fragilité et le repliement de la rétine, ainsi que certaines difficultés courantes, notamment le rétrécissement des cellules et des noyaux peu clairs, sont susceptibles de se produire lors de la fabrication d’un patch rétinien à montage entier, ce qui a un impact négatif sur la recherche expérimentale. En outre, toutes les rétines ne sont pas immunocolorées immédiatement, en particulier lorsqu’il s’agit des rétines de souris transgéniques à des prix élevés et d’origine précieuse, ce qui nécessite la préservation des échantillons rétiniens supplémentaires pour une utilisation ultérieure.
La solution fixatrice appropriée peut fixer rapidement le tissu, éviter l’autolyse tissulaire, préserver la morphologie et la structure normales des cellules tissulaires et conserver l’antigénicité des protéines et autres substances10. À l’heure actuelle, la fixation à base de formaldéhyde a été largement utilisée dans divers tissus, y compris les rétines séparées, les œillets hémisectés et les globes oculaires entiers10. Le rétrécissement tissulaire et l’altération morphologique des cellules sont les deux défis critiques rencontrés après l’immersion dans le formaldéhyde11. De plus, des formulations de fixation modifiées voient de plus en plus le jour pour maximiser la rétention des propriétés originales de la rétine et des cellules cibles 9,10. Différents traitements de fixation rétinienne peuvent affecter différemment la structure rétinienne, l’immunogénicité des protéines, l’excitation par fluorescence et le cycle de tremped’atténuation 12,13. Les rétines fixées avec la solution de Davidson sont plus morphologiquement intactes que celles fixées avec du formol, mais la solution de Davidson est moins compatible avec certains anticorps, tels que la molécule d’adaptateur de liaison au calcium ionisée par marqueur microglial 112. Compte tenu de la nature fragile des rétines, les chercheurs se demanderaient naturellement si l’intégrité rétinienne, ainsi que les propriétés et la morphologie des cellules cibles, changeront après un stockage à long terme. Cependant, les effets possibles de la solution de fixation sur la morphologie des cellules rétiniennes et RGC après stockage pendant plusieurs mois ont rarement été rapportés. L’optimisation de la fixation rétinienne est essentielle pour l’évaluation et la préservation des CGR.
Nous fournissons une description détaillée d’une méthode fiable et techniquement simple que nous utilisons pour la coloration rétinienne murine à montage entier. Notre méthode met l’accent sur la préparation et le stockage appropriés des rétines pour l’investigation du CGR, en tenant compte de la nécessité de stockage à long terme du tissu rétinien ainsi que des aspects spécifiques de la formation ou de la dégradation des fluorophores.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fixation est une étape essentielle pour préserver la rétine, ce qui peut avoir un impact sur les investigations ultérieures du RGC basées sur la morphologie. Une fixation réussie capture rapidement la structure et l’état des rétines au moment de les exposer au milieu de fixation, ce qui est essentiel pour une analyse plus approfondie. Bien que le formaldéhyde ait été considéré comme l’un des agents de fixation les plus courants pour la fixation et la conservation des tissus et des cellules, le formald…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par le projet d’ouverture des laboratoires clés du Hubei (subvention n ° 2021KFY055), la Fondation des sciences naturelles de la province du Hubei (subvention n ° 2020CFB240) et les fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (subvention n ° 2042020kf0065).
Materials
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
References
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
- Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).
- Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
- Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
- Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31 (2020).
- Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
- Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
- Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
- Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson’s solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin’s fluid or Davidson’s fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
- Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59 (2012).
- Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
- Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
- Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
