Multiplex immunofluorescentie gecombineerd met ruimtelijke beeldanalyse voor de klinische en biologische beoordeling van de micro-omgeving van de tumor

Alle monsters die in dit protocol worden gebruikt, zijn afkomstig van een studie die is goedgekeurd door de lokale ethische commissies en is goedgekeurd door de bevoegde autoriteit. Alle deelnemers aan het onderzoek gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming. De studie is geregistreerd bij ClinicalTrials.gov (NCT03608046). 1. Multiplex immunofluorescentie FFPE-sectieFixeer het weefsel in 4% paraformaldehyde en sluit het vaste weefsel in paraffine in. Snijd secties van 5 μm en plaats ze op zelfklevende microscoopglaasjes. Droog de dia’s een nacht op kamertemperatuur (RT). Deparaffinisatie en endogene peroxidasen remmingDewax de weefsels door de glaasjes onder te dompelen in tolueen (3x gedurende 5 min elk) en methanol (3x gedurende 5 min elk) onder een zuurkast. Rem de endogene peroxidasen door de glaasjes gedurende 20 minuten onder te dompelen in 3% waterstofperoxide verdund in methanol onder een zuurkast. Spoel de glaasjes af in gedestilleerd (d) H2O (1x gedurende 3 min). Multiplex immunofluorescentie kleuringDompel de dia’s onder in een 300 ml kleurpot met 10 mM citraat (pH 6) of EDTA (pH 9) buffer aangevuld met 0,1% TritonX-100.OPMERKING: De gebruikte buffer (pH 6 of pH 9) is afhankelijk van het gekleurde antigeen (zie tabel 1). Plaats de vlekpot met gesloten deksel gedurende 3-5 minuten in een magnetron op maximaal vermogen (bijv. 900 W) totdat de buffer begint te koken.OPMERKING: De optimale tijd voor koken hangt af van de magnetron en het volume van de buffer. Aanpassingen kunnen nodig zijn om de perfecte timing te vinden. Voor sommige fragiele antigenen of fragiele en minder hechtende exemplaren (bijv. organoïden en sferoïden) kan het koken in de magnetron te hard zijn. In dit geval kan in plaats daarvan een snelkookpan worden gebruikt. Houd de buffer op bijna kooktemperatuur door de gesloten kleuringspot gedurende 15 minuten in de magnetron op een laag vermogen (bijv. 90 W) te zetten. Voer de laatste stap van de verwarming uit door de magnetron gedurende 90 s op maximaal vermogen te zetten. Haal de pot uit de magnetron en laat de buffer 15 min afkoelen bij RT. Spoel de glaasjes 3x gedurende 5 min elk in dH2O en 1x gedurende 5 min in tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 (TBS-T). Verwijder de TBS-T door de dia’s op een papieren handdoek te deppen Plaats de dia’s (plat) op een vlekkamerlade of microscoopglaasje (zie Materiaaltabel). Omring het weefsel met een hydrofobe pen. Blokkeer de niet-specifieke bindingsplaatsen door het weefsel gedurende 30 minuten te bedekken met 5% runderserumalbumine (BSA) opgelost in TBS-T. Verwijder de blokkeringsbuffer door de dia’s op een papieren handdoek te deppen.OPMERKING: Spoel de dia’s niet af na de blokkeringsstap. Incubeer het weefsel gedurende 60 minuten met het primaire antilichaam (zie tabel 1) verdund in 1% BSA TBS-T door het weefsel te bedekken met ongeveer 300 μL van de oplossing. Spoel de dia’s 3x 3 minuten elk af met TBS-T. Incubeer het weefsel gedurende 40 minuten met poly-HRP secundair antilichaam (zie tabel 1) door het weefsel te bedekken met ongeveer 300 μL van de oplossing. Spoel de dia’s 3x 3 min af met TBS-T. Incubeer het weefsel gedurende 10 minuten met fluorochroom-tyramidereagens (zie tabel 1) 200-voudig verdund in boraatbuffer (0,1 M boraat, pH 7,8, 3 M NaCl) extemporeus aangevuld met 0,003% H 2 O2 door het weefsel tebedekken met ongeveer 300 μL van de oplossing. Spoel de dia’s 3x 3 min af met TBS-T. Herhaal stap 1.3.1-1.3.16 totdat alle TSA-kleuring is uitgevoerd. Incubeer het weefsel ‘s nachts bij 4 °C met het laatste primaire antilichaam (zie tabel 1) verdund in 1% BSA TBS-T.OPMERKING: Aangezien de incubatie ‘s nachts plaatsvindt, is het belangrijk om de vlekkamerlade of de microscoopschuifdoos te bedekken en dH2O toe te voegen op een papieren handdoek in de bodem van de doos (onder de dia’s) om ervoor te zorgen dat de weefsels niet drogen tijdens de incubatie. Spoel het weefsel 3x gedurende 5 min elk met TBS-T. Incubeer het weefsel gedurende 120 minuten met het secundaire antilichaam (direct gekoppeld aan fluorochroom) 200-voudig verdund in 1% BSA TBS-T. Spoel het weefsel 3x gedurende 5 min elk met TBS-T. Kleur de kernen door het weefsel gedurende 5 minuten te incuberen in bisbenzimide (20 mM) 1.000-voudig verdund in 10% BSA TBS-T.OPMERKING: Bisbenzimide kan worden vervangen door DAPI, maar de laatste is giftiger en moet voorzichtig worden behandeld onder een zuurkast. Spoel het weefsel 3x gedurende 3 min elk in dH2O. Monteer de dia’s met behulp van een fluorescentiebevestigingsmedium en een borosilicaatafdekbril. 2. Dia scannen Digitaliseer de dia’s door ze te scannen op een fluorescentiediascanner met een vergroting van 20x (details van de diascanner zijn te vinden in de materiaalopgave).OPMERKING: Een representatieve scan van een optimale multiplex wordt weergegeven in figuur 1. 3. Beeldanalyse Importeer de scans in een beeldanalysesoftware (File > Open Image). Ga naar het tabblad Classifiers en selecteer de DenseNet AI V2-plug-in . Train de DenseNet AI V2-plug-in om kernen te herkennen door ongeveer 500 kernen in één afbeelding te omringen. Train de AI op verschillende andere dia’s uit dezelfde batch en verschillende batches mIF-kleuring door verschillende kernen (50) op verschillende dia’s (ongeveer 10) te omringen.OPMERKING: Gedetailleerde instructies voor het gebruik van de AI-plug-in zijn te vinden in de softwarehandleiding. Het gebruik van AI voor kerndetectie is optioneel. Andere methoden om kernen te detecteren zijn beschikbaar, afhankelijk van de gebruikte beeldanalysesoftware. Sla de getrainde AI op (Classifier Actions > Save). Ga naar het tabblad Annotaties en maak een annotatie voor elke interesseregio (ROI), zoals het midden van de tumor en de marge van de tumor, met behulp van het gereedschap Penannotatie. Verwijder indien nodig de gebieden met vouwen en de gebieden die wazig worden weergegeven met het gereedschap Uitsluitingsannotatie.OPMERKING: Hematoxyline-eosinekleuring van een sectie naast die welke wordt gebruikt voor mIF kan worden uitgevoerd vóór de mIF-kleuring om ervoor te zorgen dat tumorcellen aanwezig zijn in het monster en om anatomopathologen te helpen de ROIs te bepalen. Ga naar het tabblad Analyse en selecteer het HighPlex FL-algoritme (Acties voor instellingen > > HighPlex FL laden). Selecteer het tabblad Kleurstofselectie en selecteer de gewenste kleurstof. Ga op het tabblad Nucleaire detectie naar Nucleair segmentatietype en selecteer AI aangepast. Selecteer in Nuclear Segmentation Classifier de AI die is opgeslagen bij stap 3.5. Kies in het tabblad Membraan- en cytoplasmadetectie de maximale cytoplasmastraal (in deze studie werd 1,5 gebruikt) en het aantal membraankleurstoffen. Selecteer voor elke kleurstof de nucleuspositieve drempel, de cytoplasmapositieve drempel en de membraanpositieve drempel.OPMERKING: De drempel is verschillend voor elke kleuring en moet worden aangepast voor elke batch dia’s en elk gekleurd antigeen. Het gebruik van het hulpprogramma Weergave-instellingen (Weergave- > weergave-instellingen) kan helpen bij het selecteren van een geschikte drempel door de intensiteitswaarde aan het einde van de intensiteitspiek (aan de rechterkant) te gebruiken. Selecteer voor elke kleurstof het kern-, membraan- en cytoplasmapercentage van volledigheidswaarden.OPMERKING: Deze parameter is belangrijk om vals-positieve detectie te voorkomen wanneer twee cellen met verschillende kleuring dicht bij elkaar staan (figuur 2). Sla het algoritme op (Instellingen, Acties, > Opslaan). Analyseer de ROI’s (analyseer > annotatielaag). Ga naar het tabblad Resultaten en selecteer alle gegevens in Objectgegevens (ctrl + A). Exporteer de gegevens in .csv indeling (klik met de rechtermuisknop > Exporteer > objectgegevens . Csv).OPMERKING: Deze tabel bevat de positie (Xmin, Xmax; Ymin, Ymax) en de positiviteit van elke marker van elke geanalyseerde cel. 4. Bioinformatica met behulp van R OPMERKING: Een R-script met meer details over de volgende stappen is beschikbaar op GitHub (benidovskaya/Ring: Pipeline for the analysis of multiplex immunofluorescence stainings. [github.com]) Definieer met behulp van de geëxporteerde tabel eerst de verschillende celtypen op basis van de colokalisatiekleuringen. Definieer bijvoorbeeld cytotoxische T-cellen door dubbelpositieve CD3+/CD8+-cellen. Reconstrueer vervolgens een vereenvoudigde afbeelding van de dia op een dot plot met behulp van de coördinaten geëxporteerd uit de beeldanalysesoftware en ggplot2 (Figuur 3). Met behulp van deze gegevens kunnen verschillende soorten analyses worden uitgevoerd:DichtheidsanalyseOPMERKING: De eenvoudigste analyse is een dichtheidsanalyse.Voer een dichtheidsanalyse uit voor alle celtypen met behulp van de hele dia voor biopsieën of een specifiek gebied van het weefsel. Bereken bijvoorbeeld de dichtheid van CD3+ en CD8+ T-cellen in het midden van de tumor en de marge van de tumor (figuur 4A-C). Om die dichtheden te berekenen, gebruikt u beeldanalysesoftware om per monster een specifiek gegevensframe te produceren met het fenotype en de coördinaten van elke cel. Maak via een clusterfunctie (k-nearest neighbor) op R een polygoonobject met behulp van de randen van de bestudeerde biopsie en bereken de dichtheid van de celtypen die erin van belang zijn.OPMERKING: Dit maakt het mogelijk om de dichtheden van verschillende celtypen te vergelijken tussen verschillende aandoeningen (zoals verschillende tijdstippen, behandelingstypen, weefseltypen en respons op de behandeling) en lokalisaties (centrum van de tumor, marge van de tumor, stromafibrose en necrosegebied), afhankelijk van de biologische hypothese. Vanwege de hoge nabijheid tussen kankercellen, peri-tumorale cellen en tumor-infiltrerende cellen, kan de beeldanalysesoftware tegelijkertijd dubbelpositieve cellen als immuun- en kankercellen detecteren. In dat geval moet men dit probleem bioinformatisch corrigeren door te vermelden wat deze dubbelpositieve cellen zijn. In dit geval werden CD3+CD8+cytokeratine+ cellen gelabeld als cytotoxische cellen omdat de cytokeratine positiviteit te wijten was aan de tumorcellen rond de infiltrerende lymfocyten. HeatmapsGebruik de dichtheid van elk celtype van verschillende panelen en door een normalisatie toe te passen (bijvoorbeeld scaling centering), teken heatmaps (figuur 5) die de celrijkdom in de populatie van monsters vertegenwoordigen. Met behulp van hiërarchische onbewaakte clustering op basis van celdichtheid, clusteren patiënten met vergelijkbare TME-samenstellingen en correleren deze clusters met klinische parameters zoals behandelingsrespons en overleving.OPMERKING: Heatmaps en clusterisatie kunnen eenvoudig worden uitgevoerd met het R ComplexHeatmap-pakket9. Ruimtelijke celverdelingBereken bioinformatisch de afstanden tussen de cellen (bijv. Immuun- en tumorcellen; Figuur 6A, B) op basis van de celcoördinaten van de beeldanalyse. Gebruik de mediane en gemiddelde afstanden tussen de celtypen van belang om de celnabijheid van alle monsters van een cohort te vergelijken. Ruimtelijke beschrijvende functiesGebruik de cross-type dichtstbijzijnde buur G-kruisfunctie, beschikbaar via het R spatstat-pakket10, om de waarschijnlijkheid te bepalen voor een cel van belang, X (bijvoorbeeld een tumorcel), die de dichtstbijzijnde cel, Y (bijvoorbeeld een T-cel), binnen een bepaalde straal rond cel X ontmoet. Bereken het gebied onder de empirische curve om een numerieke waarde te verkrijgen die de tumorinfiltratie van CD3+ T-cellen rond de tumorcellen11 vertegenwoordigt (figuur 6C). Gebruik andere ruimtelijke beschrijvende functies zoals de F-functie of J-functie12. Immunoscore analyseBereken de Immunoscore (I), ontwikkeld door het team van Galon7,8, door gebruik te maken van de dichtheid van CD3+ en CD8+ T-cellen in het midden van de tumor en de invasieve marge van de tumor.OPMERKING: De score varieert van I0 tot I4. Een lage dichtheid van zowel CD3+ als CD8+ T-cellen in het midden en de marge van de tumor is geassocieerd met een score van I0, terwijl een hoge dichtheid van CD3+ en CD8+ T-cellen in beide regio’s geassocieerd is met een score van I4. Onlangs werd de prognostische impact van de Immunocore gevalideerd in een studie met monsters van 2.681 stadium I-III darmkankerpatiënten uit 14 centra in 13 landen7. Om te worden berekend, vereist Immunoscore echter een chirurgisch gereseceerd monster dat zowel het centrum als de marge van de tumor bevat. Voor biopsieën, die meestal geen marge hebben, is onlangs een aan biopsie aangepaste Immunoscore ontwikkeld13. Om de aan de biopsie aangepaste immunoscore te berekenen, converteert u de waarde van de CD3 + en CD8 + T-celdichtheid in een percentiel en gebruikt u vervolgens het gemiddelde percentiel van CD3 + – en CD8 + T-cellen voor het scoren in een van de drie categorieën (d.w.z. laag, gemiddeld en hoog)13. Hotspot analyseGebruik hotspotanalyse, met behulp van de quadratcount-functie (spatstat)10, om de dichtheden van verschillende celtypen in het meest geïnfiltreerde gebied van het weefsel te vergelijken. Het is bijvoorbeeld mogelijk om een “Immunoscore-achtige” score te berekenen met behulp van de waarde van de CD3- en CD8 T-celdichtheid van de meest geïnfiltreerde vierkanten van het weefsel (figuur 7). Pas deze methode toe voor de analyse van elk celtype met een niet-homogene verdeling over het weefsel.