Multiplex-Immunfluoreszenz kombiniert mit räumlicher Bildanalyse zur klinischen und biologischen Beurteilung der Tumormikroumgebung

Alle im vorliegenden Protokoll verwendeten Proben stammen aus einer Studie, die von den lokalen Ethikkommissionen genehmigt und von der zuständigen Behörde genehmigt wurde. Alle Studienteilnehmer gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab. Die Studie ist bei ClinicalTrials.gov registriert (NCT03608046). 1. Multiplex-Immunfluoreszenz FFPE-SchneidenFixieren Sie das Gewebe in 4%igem Paraformaldehyd und betten Sie das fixierte Gewebe in Paraffin ein. Schneiden Sie 5 μm große Schnitte aus und legen Sie sie auf selbstklebende Objektträger. Trocknen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur (RT). Deparaffinierung und Hemmung endogener PeroxidasenEntwachsen Sie das Gewebe, indem Sie die Objektträger in Toluol (3x für je 5 min) und Methanol (3x für je 5 min) unter einen Abzug tauchen. Hemmung der endogenen Peroxidasen, indem die Objektträger 20 min lang unter Abzug in 3%iges Wasserstoffperoxid getaucht werden, das in Methanol verdünnt ist. Spülen Sie die Objektträger in destilliertem (d)H2O(1x für 3 min). Multiplex-ImmunfluoreszenzfärbungTauchen Sie die Objektträger in ein 300-ml-Färbegefäß mit 10 mM Citrat- (pH 6) oder EDTA-Puffer (pH 9), ergänzt mit 0,1 % TritonX-100.HINWEIS: Der verwendete Puffer (pH 6 oder pH 9) hängt vom gefärbten Antigen ab (siehe Tabelle 1). Stellen Sie das Färbeglas bei geschlossenem Deckel für 3-5 Minuten bei maximaler Leistung (z. B. 900 W) in die Mikrowelle, bis der Puffer zu kochen beginnt.Anmerkungen: Die optimale Zeit zum Kochen hängt von der Mikrowelle und dem Volumen des Puffers ab. Möglicherweise sind Anpassungen erforderlich, um das perfekte Timing zu finden. Für einige zerbrechliche Antigene oder zerbrechliche und weniger haftende Proben (z. B. Organoide und Sphäroide) kann das Mikrowellensieden zu hart sein. In diesem Fall kann stattdessen ein Schnellkochtopf verwendet werden. Halten Sie den Puffer auf einer Temperatur nahe dem Siedeplatz, indem Sie das geschlossene Färbegefäß 15 Minuten lang bei niedriger Leistung (z. B. 90 W) in die Mikrowelle stellen. Führen Sie den letzten Schritt des Erhitzens durch, indem Sie die Mikrowelle 90 s lang auf maximale Leistung stellen. Nehmen Sie das Glas aus der Mikrowelle und lassen Sie den Puffer 15 Minuten bei RT abkühlen. Spülen Sie die Objektträger 3x für je 5 min in dH2O und 1x für 5 min in trisgepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 (TBS-T). Entfernen Sie das TBS-T, indem Sie die Objektträger auf einem Papiertuch abtupfen Legen Sie die Objektträger (flach) auf eine Färbekammer oder einen Objektträgerkasten (siehe Materialtabelle). Umkreisen Sie das Gewebe mit einem hydrophoben Stift. Blockieren Sie die unspezifischen Bindungsstellen, indem Sie das Gewebe 30 Minuten lang mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) bedecken, das in TBS-T gelöst ist. Entfernen Sie den blockierenden Puffer, indem Sie die Objektträger auf ein Papiertuch tupfen.Anmerkungen: Spülen Sie die Objektträger nach dem Blockierungsschritt nicht aus. Inkubieren Sie das Gewebe 60 Minuten lang mit dem primären Antikörper (siehe Tabelle 1), der in 1 % BSA TBS-T verdünnt ist, indem Sie das Gewebe mit etwa 300 μl der Lösung bedecken. Spülen Sie die Objektträger 3x für jeweils 3 min mit TBS-T aus. Inkubieren Sie das Gewebe 40 Minuten lang mit Poly-HRP-Sekundärantikörpern (siehe Tabelle 1), indem Sie das Gewebe mit etwa 300 μl der Lösung bedecken. Spülen Sie die Objektträger 3x für 3 min mit TBS-T aus. Inkubieren Sie das Gewebe 10 min lang mit einem Fluorochrom-Tyramid-Reagenz (siehe Tabelle 1), das 200-fach in Boratpuffer (0,1 M Borat, pH 7,8, 3 M NaCl) verdünnt und mit 0,003 %H2O2ergänzt wird, indem das Gewebe mit etwa 300 μl der Lösung bedeckt wird. Spülen Sie die Objektträger 3x für 3 min mit TBS-T aus. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1-1.3.16, bis die gesamte TSA-Färbung durchgeführt wurde. Das Gewebe wird über Nacht bei 4 °C inkubiert, wobei der letzte Primärantikörper (siehe Tabelle 1) in 1 % BSA TBS-T verdünnt wird.Anmerkungen: Da die Inkubation über Nacht erfolgt, ist es wichtig, die Färbekammerschale oder die Objektträgerbox abzudecken und dH2O auf ein Papiertuch am Boden der Box (unter den Objektträgern) zu geben, um sicherzustellen, dass das Gewebe während der Inkubation nicht austrocknet. Spülen Sie das Gewebe 3x für je 5 min mit TBS-T aus. Inkubieren Sie das Gewebe für 120 min mit dem Sekundärantikörper (direkt gekoppelt mit Fluorochrom), der 200-fach in 1% BSA TBS-T verdünnt ist. Spülen Sie das Gewebe 3x für je 5 min mit TBS-T aus. Färben Sie die Zellkerne, indem Sie das Gewebe 5 Minuten lang in Bisbenzimid (20 mM) inkubieren, das 1.000-fach in 10% BSA TBS-T verdünnt ist.HINWEIS: Bisbenzimid kann durch DAPI ersetzt werden, letzteres ist jedoch giftiger und muss unter einem Abzug vorsichtig gehandhabt werden. Spülen Sie das Tuch 3x für je 3 min in dH2O aus. Montieren Sie die Objektträger mit einem Fluoreszenz-Eindeckmedium und Borosilikat-Deckgläsern. 2. Scannen von Objektträgern Digitalisieren Sie die Objektträger, indem Sie sie auf einem Fluoreszenz-Objektträgerscanner mit 20-facher Vergrößerung scannen (Details zum Objektträgerscanner finden Sie in der Materialtabelle).HINWEIS: Ein repräsentativer Scan eines optimalen Multiplex ist in Abbildung 1 dargestellt. 3. Bildanalyse Importieren Sie die Scans in eine Bildanalysesoftware (Datei > Bild öffnen). Gehen Sie zur Registerkarte Klassifikatoren und wählen Sie das DenseNet AI V2-Plugin aus. Trainieren Sie das DenseNet AI V2-Plugin zur Erkennung von Kernen, indem Sie etwa 500 Kerne in einem Bild umgeben. Trainieren Sie die KI auf mehreren anderen Objektträgern aus derselben Charge und verschiedenen Chargen der mIF-Färbung, indem Sie mehrere Zellkerne (50) auf mehreren Objektträgern (ca. 10) umgeben.HINWEIS: Eine detaillierte Anleitung zur Verwendung des AI-Plugins finden Sie im Softwarehandbuch. Die Verwendung von KI für die Erkennung von Kernen ist optional. Andere Methoden zur Detektion von Kernen stehen je nach verwendeter Bildanalysesoftware zur Verfügung. Speichern Sie die trainierte KI (Klassifikatoraktionen > Speichern). Wechseln Sie zur Registerkarte Anmerkungen , und erstellen Sie mit dem Stiftanmerkungswerkzeug eine Anmerkung für jede Region of Interest (ROI), z. B. die Mitte des Tumors und den Rand des Tumors. Entfernen Sie bei Bedarf die Bereiche mit Falten und die Bereiche, die verschwommen erscheinen, mit dem Ausschlussanmerkungswerkzeug.HINWEIS: Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung eines Abschnitts, der an den für die mIF verwendeten Abschnitt angrenzt, kann vor der mIF-Färbung durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass Tumorzellen in der Probe vorhanden sind, und um Anatomopathologen, die ROIs zu bestimmen. Gehen Sie zur Registerkarte Analyse und wählen Sie den HighPlex FL-Algorithmus aus (Einstellungen, Aktionen > > HighPlex FL laden). Wählen Sie die Registerkarte Farbauswahl aus, und wählen Sie den gewünschten Farbstoff aus. Wechseln Sie auf der Registerkarte ” Nukleare Erkennung ” zu ” Nuklearer Segmentierungstyp” und wählen Sie “KI benutzerdefiniert” aus. Wählen Sie unter Nuclear Segmentation Classifier die KI aus, die in Schritt 3.5 gespeichert wurde. Wählen Sie auf der Registerkarte Membran- und Zytoplasmatnachweis den maximalen Zytoplasmaradius (in dieser Studie wurde 1,5 verwendet) und die Anzahl der Membranfarbstoffe aus. Wählen Sie für jeden Farbstoff den positiven Schwellenwert für den Kern, den positiven Schwellenwert für das Zytoplasma und den Schwellenwert für den positiven Membranspiegel aus.HINWEIS: Der Schwellenwert ist für jede Färbung unterschiedlich und sollte für jede Charge von Objektträgern und jedes gefärbte Antigen angepasst werden. Mit dem Werkzeug “Ansichtseinstellungen” (Ansicht > Ansichtseinstellungen) können Sie einen geeigneten Schwellenwert auswählen, indem Sie den Intensitätswert am Ende der Intensitätsspitze (rechts) verwenden. Wählen Sie für jeden Farbstoff die Werte für den Zellkern, die Membran und das Zytoplasma aus.HINWEIS: Dieser Parameter ist wichtig, um eine Fehlalarmerkennung zu vermeiden, wenn zwei Zellen mit unterschiedlicher Färbung nahe beieinander liegen (Abbildung 2). Speichern Sie den Algorithmus (Einstellungen, Aktionen > Speichern). Analysieren Sie die ROIs (Analyze > Annotation Layer). Wechseln Sie zur Registerkarte Ergebnisse und wählen Sie alle Daten in Objektdaten aus (Strg + A). Exportieren Sie die Daten in .csv Format (klicken Sie mit der rechten Maustaste > > Objektdaten exportieren . Csv).HINWEIS: Diese Tabelle enthält die Position (Xmin, Xmax; Ymin, Ymax) und die Positivität jedes Markers jeder analysierten Zelle. 4. Bioinformatik mit R HINWEIS: Ein R-Skript mit weiteren Details zu den folgenden Schritten ist auf GitHub verfügbar (benidovskaya/Ring: Pipeline for the analysis of multiplex immunofluorescence stainings. [github.com]) Definieren Sie zunächst anhand der exportierten Tabelle die verschiedenen Zelltypen basierend auf den Kolokalisationsfärbungen. Definieren Sie z. B. zytotoxische T-Zellen durch doppelt positive CD3+/CD8+-Zellen. Rekonstruieren Sie dann ein vereinfachtes Bild der Folie in einem Punktdiagramm mit den Koordinaten, die aus der Bildanalysesoftware exportiert wurden, und ggplot2 (Abbildung 3). Anhand dieser Daten können verschiedene Arten von Analysen durchgeführt werden:DichteanalyseHINWEIS: Die einfachste Analyse ist eine Dichteanalyse.Führen Sie eine Dichteanalyse für alle Zelltypen durch, indem Sie den gesamten Objektträger für Biopsien oder einen bestimmten Bereich des Gewebes verwenden. Berechnen Sie beispielsweise die Dichte der CD3+- und CD8+-T-Zellen im Zentrum des Tumors und am Rand des Tumors (Abbildung 4A-C). Um diese Dichten zu berechnen, verwenden Sie eine Bildanalysesoftware, um einen bestimmten Datenrahmen pro Probe mit dem Phänotyp und den Koordinaten jeder Zelle zu erstellen. Erstellen Sie durch eine Clustering-Funktion (k-nächster Nachbar) auf R ein Polygonobjekt unter Verwendung der Ränder der untersuchten Biopsie und berechnen Sie die Dichte der interessierenden Zelltypen darin.HINWEIS: Dies ermöglicht den Vergleich der Dichten verschiedener Zelltypen zwischen verschiedenen Zuständen (z. B. unterschiedliche Zeitpunkte, Behandlungstypen, Gewebetypen und Ansprechen auf die Behandlung) und Lokalisationen (Zentrum des Tumors, Rand des Tumors, Stromafibrose und Nekrosebereich) je nach biologischer Hypothese. Aufgrund der hohen Nähe zwischen Krebszellen, peritumoralen Zellen und tumorinfiltrierenden Zellen kann die Bildanalysesoftware doppelt positive Zellen gleichzeitig als Immun- und Krebszellen erkennen. In diesem Fall muss man dieses Problem bioinformatisch korrigieren, indem man erwähnt, was diese doppelt positiven Zellen sind. In diesem Fall wurden CD3+CD8+Cytokeratin+-Zellen als zytotoxische Zellen markiert, da die Zytokeratin-Positivität auf die Tumorzellen zurückzuführen war, die die infiltrierenden Lymphozyten umgeben. HeatmapsZeichnen Sie unter Verwendung der Dichte jedes Zelltyps aus verschiedenen Panels und durch Anwenden einer Normalisierung (z. B. Skalierung, Zentrierung) Heatmaps (Abbildung 5), die die Zellhäufigkeit in der Grundgesamtheit der Stichproben darstellen. Unter Verwendung von hierarchischem, unüberwachtem Clustering auf der Grundlage der Zelldichte werden Patienten mit ähnlichen TME-Zusammensetzungen geclustert und diese Cluster mit klinischen Parametern wie Ansprechen auf die Behandlung und Überleben korreliert.HINWEIS: Heatmaps und Clusterisierung können problemlos mit dem R ComplexHeatmap-Paket9 durchgeführt werden. Räumliche ZellverteilungBerechnen Sie bioinformatisch die Abstände zwischen den Zellen (z. B. Immun- und Tumorzellen; Abbildung 6A, B) basierend auf den Zellkoordinaten, die durch die Bildanalyse bereitgestellt wurden. Verwenden Sie den Median und die mittleren Abstände zwischen den interessierenden Zelltypen, um die Zellnähe über alle Stichproben einer Kohorte hinweg zu vergleichen. Räumlich beschreibende FunktionenVerwenden Sie die Kreuztyp-G-Cross-Funktion des nächsten Nachbarn, die über das R spatstat-Paket10 verfügbar ist, um die Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, dass eine Zelle von Interesse, X (z. B. eine Tumorzelle), die nächstgelegene Zelle, Y (z. B. eine T-Zelle), innerhalb eines bestimmten Radius um Zelle X trifft. Berechnen Sie die Fläche unter der empirischen Kurve, um einen Zahlenwert zu erhalten, der die Tumorinfiltration von CD3+ T-Zellen um die Tumorzellendarstellt 11 (Abbildung 6C). Verwenden Sie andere räumliche Beschreibungsfunktionen wie die F-Funktion oder die J-Funktion12. Immunoscore-AnalyseBerechnen Sie den Immunoscore (I), der vom Team von Galon7,8 entwickelt wurde, indem Sie die Dichte der CD3+ und CD8+ T-Zellen im Zentrum des Tumors und den invasiven Rand des Tumors verwenden.HINWEIS: Die Punktzahl reicht von I0 bis I4. Eine niedrige Dichte von CD3+ und CD8+ T-Zellen in der Mitte und am Rand des Tumors ist mit einem Score von I0 assoziiert, während eine hohe Dichte von CD3+ und CD8+ T-Zellen in beiden Regionen mit einem Score von I4 assoziiert ist. Kürzlich wurde die prognostische Wirkung des Immunocore in einer Studie mit Proben von 2.681 Darmkrebspatienten im Stadium I-III aus 14 Zentren in 13 Ländern validiert7. Für die Berechnung des Immunoscore ist jedoch eine operativ resezierte Probe erforderlich, die sowohl das Zentrum als auch den Rand des Tumors enthält. Für Biopsien, die in der Regel keinen Rand haben, wurde kürzlich ein biopsieangepasster Immunscore entwickelt13. Um den an die Biopsie angepassten Immunscore zu berechnen, konvertieren Sie den Wert der CD3+- und CD8+-T-Zelldichte in ein Perzentil und verwenden Sie dann das mittlere Perzentil der CD3+- und CD8+-T-Zellen für die Einstufung in eine von drei Kategorien (d. h. niedrig, mittel und hoch)13. Hotspot-AnalyseVerwenden Sie die Hotspot-Analyse, indem Sie die Quadratzählfunktion (spatstat)10 verwenden, um die Dichten verschiedener Zelltypen im am stärksten infiltrierten Bereich des Gewebes zu vergleichen. Zum Beispiel ist es möglich, einen “Immunoscore-ähnlichen” Score zu berechnen, indem man den Wert der CD3- und CD8-T-Zelldichte der am stärksten infiltrierten Quadrate des Gewebes verwendet (Abbildung 7). Wenden Sie diese Methode für die Analyse aller Zelltypen mit einer inhomogenen Verteilung über das Gewebe an.