Evaluación de la respuesta inmune de una vacuna adyuvante de nanoemulsión contra la infección por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM)
Summary
El presente protocolo prepara y evalúa las propiedades físicas, la respuesta inmune y el efecto protector in vivo de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión.
Abstract
Las vacunas adyuvantes de nanoemulsión han atraído una gran atención debido a su pequeño tamaño de partícula, alta estabilidad térmica y capacidad para inducir respuestas inmunes válidas. Sin embargo, establecer una serie de protocolos integrales para evaluar la respuesta inmune de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión es vital. Por lo tanto, este artículo presenta un procedimiento riguroso para determinar las características fisicoquímicas de una vacuna (por microscopía electrónica de transmisión [TEM], microscopía de fuerza atómica [AFM] y dispersión dinámica de luz [DLS]), la estabilidad del antígeno y el sistema de la vacuna (mediante una prueba de centrífuga de alta velocidad, una prueba de estabilidad termodinámica, SDS-PAGE y western blot), y la respuesta inmune específica (IgG1, IgG2a e IgG2b). Usando este enfoque, los investigadores pueden evaluar con precisión el efecto protector de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión en un modelo letal MRSA252 ratón. Con estos protocolos, se puede identificar el adyuvante de vacuna de nanoemulsión más prometedor en términos de potencial adyuvante efectivo. Además, los métodos pueden ayudar a optimizar nuevas vacunas para el desarrollo futuro.
Introduction
El Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) es un patógeno oportunista con una de las tasas de infección más altas en una unidad de cuidados intensivos (UCI) salas1, departamentos de cardiología y departamentos de quemaduras en todo el mundo. El SARM exhibe altas tasas de infección, mortalidad y amplia resistencia a los medicamentos, presentando grandes dificultades en el tratamiento clínico2. En la Lista de prioridad mundial de bacterias resistentes a los antibióticos publicada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en 2017, MRSA se incluyó en la categoría3 más crítica. Por lo tanto, se necesita urgentemente una vacuna contra la infección por SARM.
El adyuvante de aluminio se ha utilizado durante mucho tiempo, y el mecanismo auxiliar adyuvante es relativamente claro, seguro, efectivo y bien tolerado4. Los adyuvantes de aluminio son actualmente un tipo de adyuvante ampliamente utilizado. En general, se cree que los antígenos adsorbidos en partículas de sal de aluminio pueden mejorar la estabilidad y mejorar la capacidad del sitio de inyección para absorber antígenos, proporcionando una buena absorción y liberación lenta5. Actualmente, la principal desventaja de los adyuvantes de aluminio es que carecen de un efecto adyuvante o exhiben solo un efecto adyuvante débil en algunos antígenos candidatos a vacuna6. Además, los adyuvantes de aluminio inducen reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE5. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevos adyuvantes para estimular una respuesta inmune más fuerte.
Los adyuvantes de nanoemulsión son sistemas de dispersión coloidal compuestos de aceite, agua, tensioactivos y cosurfactantes7. Además, los adyuvantes son termodinámicamente estables e isótropos, pueden ser esterilizados en autoclave o estabilizados por centrifugación de alta velocidad, y pueden formarse espontáneamente en condiciones de preparación suaves. Varios adyuvantes de emulsión (como MF59, NB001-002 series, AS01-04 series, etc.) están actualmente en el mercado o en la etapa de investigación clínica, pero sus tamaños de partícula son superiores a 160 nm8. Por lo tanto, las ventajas de las preparaciones medicinales a nanoescala (1-100 nm) (es decir, área de superficie específica grande, tamaño de partícula pequeño, efecto de superficie, energía superficial alta, efecto de tamaño pequeño y efecto túnel macrocuántico) no pueden explotarse plenamente. En el presente protocolo, se ha informado que un nuevo adyuvante basado en tecnología de nanoemulsión con un tamaño de diámetro de 1-100 nm exhibe una buena actividad adyuvante9. Probamos la proteína HI del antígeno de la vacuna de la subunidad de recombinación (mutante de α-hemolisina [Hla] y la proteína de fusión de fragmentos activos de la subunidad N2 del factor de determinación de la superficie de iones Fe [IsdB]); Se establecieron una serie de procedimientos para examinar las propiedades físicas y la estabilidad, evaluar su respuesta específica de anticuerpos después de la administración intramuscular y probar el efecto protector de la vacuna utilizando un modelo de infección sistémica de ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
IsdB, una proteína de superficie bacteriana anclada a la pared celular y regulada por hierro, juega un papel importante en el proceso de obtención de hierro hemo15. Hla, toxina alfa, es una de las toxinas bacterianas más efectivas conocidas en MRSA, y puede formar poros en células eucariotas e interferir con la adhesión y las células epiteliales16. En nuestro estudio, se construyó una nueva proteína de antígeno MRSA (HI) de recombinación y se exp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el No. 2021YFC2302603 del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China, el No. 32070924 y 32000651 del NSFC, y el No. 2019jcyjA-msxmx0159 del Programa de Proyectos de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing.
Materials
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
References
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