High-throughput contractiele metingen van hydrogel-ingebedde intacte muisspiervezels met behulp van een op optica gebaseerd systeem
Summary
De skeletspierfunctie kan worden beoordeeld door de contractiliteit van geïsoleerde spiervezels te kwantificeren, traditioneel met behulp van bewerkelijke benaderingen met een lage doorvoer. Hier beschrijven we een op optica gebaseerde, high-throughput methode om de contractiliteit van hydrogel-ingebedde spiervezels te kwantificeren. Deze aanpak heeft toepassingen voor geneesmiddelenscreening en therapeutische ontwikkeling.
Abstract
In vitro celkweek is een krachtig hulpmiddel om cellulaire processen te beoordelen en therapeutische strategieën te testen. Voor skeletspieren omvatten de meest voorkomende benaderingen het differentiëren van myogene voorlopercellen in onrijpe myotubes of de korte termijn ex vivo cultuur van geïsoleerde individuele spiervezels. Een belangrijk voordeel van ex vivo cultuur ten opzichte van in vitro is het behoud van de complexe cellulaire architectuur en contractiele kenmerken. Hier beschrijven we een experimenteel protocol voor de isolatie van intacte flexor digitorum brevis spiervezels van muizen en hun daaropvolgende ex vivo cultuur. In dit protocol zijn spiervezels ingebed in een op fibrine gebaseerde en keldermembraanmatrixhydrogel om de vezels te immobiliseren en hun contractiele functie te behouden. Vervolgens beschrijven we methoden om de contractiele functie van de spiervezel te beoordelen met behulp van een op optica gebaseerd, contractiliteitssysteem met hoge doorvoer. De ingebedde spiervezels worden elektrisch gestimuleerd om contracties te induceren, waarna hun functionele eigenschappen, zoals sarcomeerverkorting en contractiele snelheid, worden beoordeeld met behulp van op optica gebaseerde kwantificering. Het koppelen van spiervezelcultuur aan dit systeem maakt high-throughput testen van de effecten van farmacologische middelen op de contractiele functie en ex vivo studies van genetische spieraandoeningen mogelijk. Ten slotte kan dit protocol ook worden aangepast om dynamische cellulaire processen in spiervezels te bestuderen met behulp van live-cell microscopie.
Introduction
Vooruitgang in in vitro celkweektechnieken heeft nieuwe mogelijkheden geopend om weefselregeneratieve vermogens, pathofysiologische cellulaire mechanismen en daaropvolgende therapeutische strategieën te bestuderen, allemaal met behulp van zoogdierweefsels onder goed gecontroleerde omstandigheden 1,2,3. Het gebruik van in vitro kweeksystemen is goed ingeburgerd binnen het spieronderzoeksveld 4,5. Over het algemeen worden in vitro gedifferentieerde onrijpe myotubes van myogene voorlopercellen gebruikt 2,6,7,8. Hoewel er vooruitgang is geboekt in het differentiatieprotocol om meer volwassen spiervezelste genereren 9, beperkt hun onvolwassenheid nog steeds de vertaling van de bevindingen naar een in vivo setting 1,10. Een centraal probleem op het gebied van spierbiologie is het onvermogen van in vitro gedifferentieerde myobuizen om de complexe intracellulaire structuren, celsignaleringsprocessen en extracellulaire interacties die worden waargenomen in inheems spierweefsel volledig te belichamen en, belangrijker nog, de contractiele krachten geproduceerd door spiervezels samen te vatten 1,2,10,11,12 . Bovendien resulteert de ongecoördineerde samentrekking van myotubes tijdens het differentiatieproces vaak in spontane onthechting van de kweekschalen, waardoor de contractiele beoordeling van in vitro gedifferentieerde myotubes uitdagend is en beperkt tot kwalitatieve of semi-kwantitatieve evaluatie 8,11,12,13. Deze beperkingen vereisen vaak regelmatige in vivo experimenten met dieren, vooral als spiercontractiliteit een primaire experimentele uitkomst is1.
Een alternatief voor het kweken in vitro-gedifferentieerde myotubes is de ex vivo kweek van geïsoleerde volwassen spiervezels 1,14. Tijdens ex vivo kweek wordt ontwikkelingsrijp spierweefsel uit het lichaam weggesneden, gevolgd door eencellige isolatie voor kweek in laboratoriumomstandigheden 1,14. De geïsoleerde volwassen spiervezels behouden hun complexe cellulaire structuren waargenomen in het inheemse weefsel14,15, en deze methode opent de mogelijkheid voor directe interventies, zoals genetische manipulatie en medicijnscreening, in een goed gedefinieerde en controleerbare kweekomgeving. Een van de eerste rapporten over skeletspiervezelisolatie en ex vivo cultuur dateert uit de jaren 1930; De opbrengst van levensvatbare vezels uit dit protocol was echter laag16. Met de voortdurende optimalisatie van de isolatieprocedure en kweekomstandigheden is nu een significante verbetering van de hoeveelheid levensvatbare en functionele spiervezels mogelijk 14,15,17,18,19. Een dergelijke verbetering van de kweekomstandigheden omvat het coaten van kweekschalen met extracellulaire matrixeiwitten om de hechting van de geïsoleerde spiervezels op de kweekschaalte bevorderen 15,18,20. Meestal wordt lamininecoating gebruikt, omdat laminine een van de meest voorkomende elementen is in de extracellulaire matrix van spieren20,21. De optimalisatie van de isolatieprocedure in combinatie met de coating van de kweekschalen hebben het spieronderzoeksveld in staat gesteld om geïsoleerde levensvatbare spiervezels met intacte cellulaire architectuur en contractiele functionaliteit gedurende korte tijd in cultuur te houden 1,15,18,22.
De meest conventionele benadering die binnen het spierveld wordt gebruikt om kracht en contractiele capaciteiten te meten, is om individuele spiervezels te monteren tussen een lengtedrivermotor en een krachtopnemer23,24. Over het algemeen worden de spiervezels die worden gebruikt voor deze motoraangedreven opstellingen ontleed uit snap-frozen of vers weefsel, gevolgd door permeabilisatie of “skinning”, wat externe calciumactivering mogelijk maakt, waarbij verschillende calciumconcentraties worden gebruikt om spiervezelcontractie te induceren24. Hoewel deze methode de gouden standaard is voor contractiele metingen van spiervezels, kan slechts één spiervezel tegelijk worden gemeten, waardoor deze techniek een arbeidsintensieve en tijdrovende procedure is25. Bovendien verstoort de isolatie- en skinningprocedure van de spiervezels de verschillende structuren die betrokken zijn bij excitatie-contractiekoppeling (d.w.z. calciumafgifte en daaropvolgende heropname in het sarcoplasmatisch reticulum), waardoor de studie van ontspanningskinetiek en eventuele ziekten die dit proces kunnen beïnvloeden niet mogelijk is26,27. Een alternatief voor het gevilde vezelpreparaat is het gebruik van mechanische dissectie om intacte spiervezels te isoleren, waarbij contractiele krachten kunnen worden gemeten als reactie op elektrische activering28; Deze aanpak is echter technisch uitdagend en zeer tijdrovend, wat resulteert in metingen met een lage doorvoer. Ten slotte worden in zowel gevilde als intacte preparaten de spiercellen volledig verwijderd uit de extracellulaire omgeving tijdens contractiele metingen 24, waardoor het onderzoek naar het effect van de extracellulaire matrixsamenstelling / stijfheid op spiervezelcontractie onmogelijk is24. Als gevolg hiervan is de ontwikkeling van alternatieve methoden nodig om spiervezelcontractiliteitsmetingen van geïsoleerde intacte spiervezels op een high-throughput-manier mogelijk te maken, terwijl de verbinding tussen spiervezels en de extracellulaire matrix opnieuw wordt gecreëerd.
Onlangs is een nieuwe op optica gebaseerde benadering voor spiervezelcontractiliteitsmetingen met hoge doorvoer ontwikkeld29. Dit op optica gebaseerde systeem meet de periodiciteit van sarcomeren om de sarcomeerlengte tijdens contractie te beoordelen met behulp van high-speed imaging. Binnen dit systeem blijven de cellen op hun plaats in de kweekschaal terwijl de optica wordt verplaatst, waardoor de tijd die nodig is tussen de metingen van meerdere cellen wordt geminimaliseerd29. Een groot voordeel van het gebruik van deze op optica gebaseerde benadering met hoge doorvoer is dat het kweekomstandigheden kan ontwikkelen die vergelijkbaar zijn met die van het inheemse weefsel. Een benadering die wordt gebruikt om inheemse in vivo omstandigheden na te bootsen, is het inbedden van cellen in hydrogels30. Typisch, een hydrogel is een visco-elastisch materiaal dat in staat is om zijn volume en vorm te behouden, en hydrogels hebben de eigenschappen van zowel vaste als vloeibare materialen31. Het vaste deel bestaat uit polymeerketens die met elkaar verbonden zijn, waardoor een structuur ontstaat die lijkt op een netto30,31. De materiaaleigenschappen van hydrogels kunnen worden afgestemd om de matrixafzetting van spieren na te bootsen30,31. De combinatie van een op optica gebaseerd systeem met hoge doorvoer en cellen ingebed in hydrogels opent dus nieuwe mogelijkheden om de effecten van extracellulaire matrixsamenstelling en mechanische eigenschappen op spiervezelfunctionaliteit te beoordelen.
Het algemene doel van dit artikel is om 1) de methodologie te beschrijven voor de enzymatische isolatie en ex vivo cultuur van spiervezels in omstandigheden die de inheemse weefselomgeving nabootsen en 2) spiervezelcontractiliteit te beoordelen met behulp van een high-throughput benadering. We beschrijven een gedetailleerde methodologie om eenvoudig een groot aantal enkele spiervezels te isoleren uit de flexor digitorum brevis (FDB) spier met behulp van enzymatische spijsvertering. Daarnaast beschrijven we een techniek om de geïsoleerde spiervezels in te bedden in een op fibrine gebaseerde hydrogel om de oorspronkelijke omgeving van de spieren na te bootsen en de levensvatbaarheid en contractiliteit van de spiervezel te verbeteren. Vervolgens schetsen we een high-throughput methode voor het meten van levende spiervezelcontracties in vitro met behulp van dit recent ontwikkelde systeem. Een bijkomend voordeel van deze inbeddingsprocedure is de immobilisatie van vezels tijdens contractie, wat de signaal-ruisverhouding van deze metingen kan verbeteren. Deze gel-inbeddingsmethode is van toepassing op zowel inkapselingsprocedures met één polymeer als composietgel, waardoor de beoordeling van de effecten van extracellulaire matrixsamenstelling op spiervezelcontractiliteit wordt vergemakkelijkt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een protocol om de enzymatische isolatie en cultuur van FDB-spiervezels in een 3D-cultuurformaat uit te voeren, gevolgd door contractiele metingen met behulp van een op optica gebaseerd contractiel meetsysteem. Dit protocol heeft een aantal voordelen, waaronder de 1) rechttoe rechtaan en tijdige isolatie van veel intacte spiervezels uit een enkele spier; 2) de inbedding van de spiervezels in een afstembare hydrogelmatrix; 3) het uitvoeren van contractiliteitsmetingen met hoge doorvoer met behulp van het op optica gebaseerde systeem; en 4) het vermogen om herhaalde metingen van dezelfde spiervezels uit te voeren na een interventie. De isolatie van enkele levende spiervezels zorgt voor volwassen spiercellen die hun contractiele functie behouden. Omdat de spiervezels verkregen uit de FDB van de muis relatief klein zijn, zijn ze gemakkelijk te manipuleren tijdens isolatie en behouden ze hun rechte vorm, waardoor stroomafwaartse contractiele metingen mogelijk zijn. Hoewel het systeem in de eerste plaats is ontwikkeld om de contractie van cardiomyocyten te bestuderen, bevatten skeletspiervezels dezelfde contractiele machinerie met gemakkelijk te onderscheiden sarcomeerpatronen en kunnen ze dus ook met dit systeem worden gemeten29. De koppeling van eencellige contractiele metingen met levende ex vivo spiervezelcultuur is een krachtig hulpmiddel om de gezondheid en functie van volwassen spiervezels te beoordelen als reactie op elektrische activering.
Een beperking van het gebruik van gedissocieerde spiervezels is het ontbreken van externe krachten (d.w.z. passieve rek) toegepast op de vezels, wat resulteert in lagere rustende sarcomeerlengtes in vergelijking met die in vivo. Hoewel een sarcomeerlengte van 2,4-2,5 μm zorgt voor een optimale krachtproductie, kan de rustende sarcomeerlengte sterk variëren33. Hoewel de in vivo rustende sarcomeerlengte van de FDB nog niet is beschreven, suggereren onze eigen ongepubliceerde gegevens een gemiddelde lengte van 2,2 μm. De huidige resultaten tonen een gemiddelde rustsarcomeerlengte van ~1,95 μm in onbelaste FDB-vezels na 24 uur in cultuur (figuur 3). Hoewel deze lagere rustsarcomeerlengte zou resulteren in een lagere krachtproductie, zou een lengte van ~ 1,95 μm nog steeds >90% van de maximale kracht34 moeten produceren. Als zodanig moeten deze sarcomeerlengtes voldoende zijn om verschillen in vezelfunctie tussen verschillende genetische modellen of na medicamenteuze behandelingen te bepalen. Bovendien biedt de inbedding van vezels in een hydrogel veel extra punten voor hechting in vergelijking met vrij zwevende 2D-gekweekte vezels, wat verdere verkorting van sarcomeer in de loop van de tijd zou beperken.
Een voordeel van dit spiervezelisolatieprotocol is het gebruik van een gemakkelijk te ontleden fast-twitch spier bestaande uit relatief kleine spiervezels in vergelijking met andere spieren, zoals de extensor digitorum longus (EDL). Hun kleinere formaat maakt de spierisolatie meer geschikt voor trituratie op basis van scheiding, waardoor de kans op door pipet of klitten veroorzaakte schade aan de spiervezels wordt verminderd. De extracellulaire matrix van FDB-spieren kan gemakkelijk enzymatisch worden verteerd met collagenase, waardoor honderden spiervezels in korte tijd kunnen worden geïsoleerd. Overdigestie kan echter leiden tot schade aan de spiervezels. De overdigestie van de spiervezels kan worden herkend wanneer de spier vrijwel onmiddellijk uit elkaar valt bij het tritureren van de spier of wanneer een groot deel van het celvolume wordt samengetrokken tijdens de celzaaiprocedure. Om overdigestie van de spier te voorkomen, moet de verteringstijd voor elke collagenasebatch worden geoptimaliseerd. Om dit te testen, moeten twee FDB-spieren parallel worden verteerd met een gespreide verteringstijd van 5 minuten ertussen. De verteringstijd met de hoogste opbrengst van levensvatbare spiervezels moet worden gekozen. Deze optimalisatie moet vervolgens een tweede keer worden uitgevoerd, opnieuw met 5 minuten scheiding in de verteringstijd. De verteringstijd die de hoogst levensvatbare spiervezels oplevert, moet worden gebruikt als de optimale verteringstijd voor de huidige partij collagenase. Een andere manier om de batch-to-batch variabiliteit van collagenase te beperken, zou zijn om de activiteitseenheden per milliliter stockoplossing direct te berekenen en vervolgens de volgende collagenasebatches tot dezelfde hoeveelheid te reconstitueren. Ten slotte moeten de verteringstijden mogelijk worden geoptimaliseerd voor verschillende muizenstammen, bijvoorbeeld bij het bestuderen van oudere of zieke dieren die een verhoogde extracellulaire matrixafzetting vertonen35,36.
De mogelijkheid om levensvatbare geïsoleerde spiervezels te pipetteren opent mogelijkheden om FDB-spiervezels in verschillende kweekomstandigheden te kweken. Een van die opties is het kweken van deze vezels in hydrogels om de inheemse weefselkweekomgeving na te bootsen. Dit inbeddingsprotocol zorgt ervoor dat de vezels op hun plaats blijven tijdens de contractiele metingen en is geoptimaliseerd om de vezels naar de bodem van de plaat te laten zakken voordat de gel uitzet. Dit protocol moet echter mogelijk worden aangepast om rekening te houden met verschillen in de trombine- en fibrinogeenvoorraden. Als de trombineactiviteit te hoog is, zal de gel voortijdig uitzetten en kunnen de vezels op hogere locaties buiten het brandpuntsvlak van de microscoop blijven hangen. Als dit gebeurt, moet de trombine:fibrinogeenverhouding worden aangepast. Dit kan worden getest door vezels in steeds lagere trombineconcentraties te plateren en te noteren hoe lang de polymerisatie duurt. Meestal mag dit niet sneller dan 30 minuten gebeuren. Het hebben van een te lage trombineconcentratie kan echter ook het polymerisatieproces schaden. Een andere methode om ervoor te zorgen dat de vezels zich in het juiste brandpuntsvlak bevinden, is om ze eerst te zaaien met behulp van een 2D-protocol en vervolgens een laag hydrogel over de vezels toe te voegen nadat ze zich aan de kweekplaat hebben gehecht. Men moet zich er echter van bewust zijn dat het verwijderen van het medium uit de vezels hypercontractie kan veroorzaken, omdat ze gevoelig zijn voor uitdroging. Het is ook onduidelijk of de hydrogel zich volledig aan de kweekplaat zal hechten en deze kan gemakkelijker loskomen. Daarom heeft deze inbeddingsprocedure de voorkeur om vezels levensvatbaar te houden en op hun plaats te houden voor contractiemetingen.
Het gebruik van dit protocol maakt de studie van de contractiele dynamiek van volwassen spiervezels ex vivo mogelijk en kan worden toegepast op zowel gezonde muizen als degenen die genetische mutaties voor spierziekten dragen. Op dezelfde manier maakt het het mogelijk om te testen hoe kweekomstandigheden of de toevoeging van verbindingen de spiervezelfunctie beïnvloeden. De contractiele gegevens verkregen met behulp van het op optica gebaseerde systeem geven een indicatie van het contractiele vermogen van levende enkele spiervezels, en veranderingen in dit vermogen kunnen worden gecorreleerd aan de gezondheid van vezels. Deze gegevens alleen zijn echter niet voldoende om te bepalen of deze veranderingen optreden in de actine-myosine kruisoverbruggings- of calciumafgiftestadia van spiercontractie. Hoewel we in dit protocol geen methoden beschrijven om calciumsignalering te meten, is deze opstelling ook in staat om op Fura gebaseerde calciumtransiënten te meten in samentrekkende spiercellen29. Een nadeel van dit systeem is dat de FDB-spier alleen fast-twitch type IIa / IIx-spiervezels bevat, en spieren die slow-twitch type I-vezels van deze grootte bevatten, zijn nog niet beschreven37. Dit elimineert de mogelijkheid om vezeltype-specifieke werking te bestuderen met behulp van deze methode. Het protocol dat we hier voorstellen, kan mogelijk worden aangepast voor andere spieren zoals de EDL of de soleus om vezeltypeverschillen te bestuderen. Vanwege hun grotere omvang zou dit protocol verder moeten worden geoptimaliseerd voor deze spieren. Langere vezels hebben de neiging om verstrikt te raken tijdens de zwaartekrachtbezinkingsstap en zullen scheuren als ze worden gemanipuleerd door pipetteren, wat zou leiden tot een lagere opbrengst. Door hun incompatibiliteit met pipetteren zijn langere vezels daarom ook minder compatibel met de gel-embedding techniek. Metingen van deze vezels kunnen nog steeds worden uitgevoerd in een 2D-cultuurformaat, maar de vezels kunnen meer bewegen tijdens de contractie vanwege hun grootte, waardoor de signaal-ruisverhouding wordt beïnvloed. Een andere beperking van dit systeem is het onvermogen om krachtmetingen uit te voeren naast de contractiele metingen, zoals die krachtmetingen die kunnen worden verkregen met behulp van andere intacte spiervezelpreparaten28. Deze beperking kan echter worden omzeild door de kracht te schatten die door de spiervezel wordt gegenereerd. De gegenereerde kracht van spiervezels kan worden geschat als de spiervezelvorm tijdens samengetrokken en ontspannen toestanden en de Young’s modulus van de matrix bekend zijn25. Niettemin biedt dit op optische basis gebaseerde systeem een eenvoudig te gebruiken, high-throughput benadering voor het bestuderen van spiercontractiele functie en opent het een reeks nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van genetische spierziekten en therapeutische interventies.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Sylvia Bogaards, Sanna Luijcx, Valentijn Jansen, Michiel Helmes en Emmy Manders bedanken voor hun technische expertise bij het helpen ontwikkelen van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door prijzen van de Muscular Dystrophy Association (Development Award MDA603238 to T.J.K), de Dutch Cardiovascular Alliance (Talent Grant to T.J.K) en de National Health and Medical Research Council (NHMRC, Australië; Fellowship APP1121651 aan M.Y).
Materials
| Aprotinin, from Bovine Lung | Thermo Scientific | AAJ63039MC | 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Collagenase type 2 | Worthington | 77336 | 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma Aldrich | 50-176-5054 | 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413201 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Gibco MEM High glucose + pyruvate | Thermo Fisher | 11095080 | |
| Horse serum | Thermo Fisher | H1270 | |
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Serum Replacement 2 (50x) | Sigma Aldrich | S9388 | |
| Thrombin, Bovine Plasma | Thermo Scientific | AAJ63383EXP | 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Tranexamic Acid | Thermo Scientific | AC228042500 | 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Equipment | |||
| 24-well electrical stimulator | IonOptix | N/a | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| MultiCell Cytocypher | IonOptix | N/a | |
| MyoCam-S3 | IonOptix | N/a | |
| MyoPacer | IonOptix | N/a | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent | Dow corning | N/a | |
| Vannas Spring Scissor – 25 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Software | |||
| CytoSolver | IonOptix | N/a | |
| IonWizard | IonOptix | N/a |
References
- Smith, L. R., Meyer, G. A. Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment. Connective Tissue Research. 61 (3-4), 248-261 (2020).
- Khodabukus, A., Prabhu, N., Wang, J., Bursac, N. In vitro tissue-engineered skeletal muscle models for studying muscle physiology and disease. Advanced Healthcare Materials. 7 (15), 1701498 (2018).
- Fernandez-Costa, J. M., Fernandez-Garibay, X., Velasco-Mallorqui, F., Ramon-Azcon, J. Bioengineered in vitro skeletal muscles as new tools for muscular dystrophies preclinical studies. Journal of Tissue Engineering. 12, 2041731420981339 (2021).
- Romagnoli, C., Iantomasi, T., Brandi, M. L. Available in vitro models for human satellite cells from skeletal muscle. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13221 (2021).
- Dessauge, F., Schleder, C., Perruchot, M. -. H., Rouger, K. 3D in vitro models of skeletal muscle: Myopshere, myobundle and bioprinted muscle construct. Veterinary Research. 52 (1), 72 (2021).
- Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle. Cell Biology International. 37 (2), 191-196 (2013).
- Guo, X., et al. In vitro differentiation of functional human skeletal myotubes in a defined system. Biomaterials Science. 2 (1), 131-138 (2014).
- Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
- Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In vitro differentiation of mature myofibers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
- Khodabukus, A. Tissue-engineered skeletal muscle models to study muscle function, plasticity, and disease. Frontiers in Physiology. 12, 619710 (2021).
- Engler, A. J., et al. Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: Pathological implications for soft or stiff microenvironments. Journal of Cell Biology. 166 (6), 877-887 (2004).
- Huang, N. F., et al. Myotube assembly on nanofibrous and micropatterned polymers. Nano Letters. 6 (3), 537-542 (2006).
- Earle, A. J., et al. Mutant lamins cause nuclear envelope rupture and DNA damage in skeletal muscle cells. Nature Materials. 19 (4), 464-473 (2020).
- Stange, K., Ahrens, H. E., von Maltzahn, J., Rontgen, M. Isolation and ex vivo cultivation of single myofibers from porcine muscle. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 56 (8), 585-592 (2020).
- Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system–A more mature muscle culture system. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
- Ramsey, R. W., Street, S. F. The isometric length-tension diagram of isolated skeletal muscle fibers of the frog. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 15 (1), 11-34 (1940).
- Selvin, D., Hesse, E., Renaud, J. M. Properties of single FDB fibers following a collagenase digestion for studying contractility, fatigue, and pCa-sarcomere shortening relationship. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), R467-R479 (2015).
- Renzini, A., et al. Culture conditions influence satellite cell activation and survival of single myofibers. European Journal of Translational Myology. 28 (2), 7567 (2018).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Holmberg, J., Durbeej, M. Laminin-211 in skeletal muscle function. Cell Adhesion and Migration. 7 (1), 111-121 (2013).
- Stuelsatz, P., Keire, P., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation, culture, and immunostaining of skeletal muscle myofibers from wildtype and nestin-GFP mice as a means to analyze satellite cell. Methods in Molecular Biology. 1556, 51-102 (2017).
- Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
- Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
- Ottenheijm, C. A., et al. Altered myofilament function depresses force generation in patients with nebulin-based nemaline myopathy (NEM2). Journal of Structural Biology. 170 (2), 334-343 (2010).
- Rausch, M., et al. Measurement of skeletal muscle fiber contractility with high-speed traction microscopy. Biophysical Journal. 118 (3), 657-666 (2020).
- de Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 754-767 (2020).
- Wijnker, P. J. M., vander Velden, J. Mutation-specific pathology and treatment of hypertrophic cardiomyopathy in patients, mouse models and human engineered heart tissue. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1866 (8), 165774 (2020).
- Cheng, A. J., Westerblad, H. Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca(2+)] in fully intact single skeletal muscle fibers. Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).
- Cao, L., Manders, E., Helmes, M. Automatic detection of adult cardiomyocyte for high throughput measurements of calcium and contractility. PLoS One. 16 (9), e0256713 (2021).
- Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2010).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical Research. 26 (3), 631-643 (2009).
- Cold Spring Harbor Protocols. Sylgard-coated coverslips and petri dishes. Cold Spring Harbor Protocols. 2022 (8), (2022).
- Moo, E. K., Fortuna, R., Sibole, S. C., Abusara, Z., Herzog, W. In vivo sarcomere lengths and sarcomere elongations are not uniform across an intact muscle. Frontiers in Physiology. 7, 187 (2016).
- Moo, E. K., Leonard, T. R., Herzog, W. The sarcomere force-length relationship in an intact muscle-tendon unit. Journal of Experimental Biology. 223, 215020 (2020).
- Schuler, S. C., et al. Extensive remodeling of the extracellular matrix during aging contributes to age-dependent impairments of muscle stem cell functionality. Cell Reports. 35 (10), 109223 (2021).
- Carberry, S., Zweyer, M., Swandulla, D., Ohlendieck, K. Proteomics reveals drastic increase of extracellular matrix proteins collagen and dermatopontin in the aged mdx diaphragm model of Duchenne muscular dystrophy. International Journal of Molecular Medicine. 30 (2), 229-234 (2012).
- Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skeletal Muscle. 8 (1), 14 (2018).
