قياسات انقباضية عالية الإنتاجية لألياف عضلات الفأر السليمة المضمنة في الهيدروجيل باستخدام نظام قائم على البصريات
Summary
يمكن تقييم وظيفة العضلات الهيكلية عن طريق تحديد انقباض ألياف العضلات المعزولة ، وذلك تقليديا باستخدام أساليب شاقة منخفضة الإنتاجية. هنا ، نصف طريقة عالية الإنتاجية قائمة على البصريات لتحديد انقباض ألياف العضلات المدمجة في الهيدروجيل. هذا النهج له تطبيقات لفحص الأدوية والتطوير العلاجي.
Abstract
تعد زراعة الخلايا في المختبر أداة قوية لتقييم العمليات الخلوية واختبار الاستراتيجيات العلاجية. بالنسبة للعضلات الهيكلية ، تتضمن الأساليب الأكثر شيوعا إما تمييز الخلايا السلفية العضلية المنشأ إلى أنابيب عضلية غير ناضجة أو الثقافة خارج الجسم الحي قصيرة المدى لألياف العضلات الفردية المعزولة. تتمثل إحدى الفوائد الرئيسية للثقافة خارج الجسم الحي في المختبر في الاحتفاظ بالبنية الخلوية المعقدة والخصائص المقلصة. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول تجريبي لعزل ألياف العضلات المثنية المثنية السليمة من الفئران وثقافتها اللاحقة خارج الجسم الحي. في هذا البروتوكول ، يتم تضمين ألياف العضلات في هيدروجيل مصفوفة الغشاء القائم على الفيبرين والغشاء القاعدي لشل حركة الألياف والحفاظ على وظيفتها المقلصة. ثم نصف طرق تقييم وظيفة انقباض الألياف العضلية باستخدام نظام انقباض عالي الإنتاجية قائم على البصريات. يتم تحفيز الألياف العضلية المدمجة كهربائيا للحث على الانقباضات ، وبعد ذلك يتم تقييم خصائصها الوظيفية ، مثل تقصير القطعة العضلية وسرعة الانقباض ، باستخدام القياس الكمي القائم على البصريات. يسمح اقتران زراعة الألياف العضلية بهذا النظام بإجراء اختبار عالي الإنتاجية لتأثيرات العوامل الدوائية على وظيفة الانقباض والدراسات خارج الجسم الحي لاضطرابات العضلات الوراثية. أخيرا ، يمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول لدراسة العمليات الخلوية الديناميكية في ألياف العضلات باستخدام الفحص المجهري للخلايا الحية.
Introduction
فتحت التطورات في تقنيات زراعة الخلايا في المختبر إمكانيات جديدة لدراسة قدرات تجديد الأنسجة ، والآليات الخلوية الفيزيولوجية المرضية ، والاستراتيجيات العلاجية اللاحقة ، كل ذلك أثناء استخدام أنسجة الثدييات في ظل ظروف جيدة التحكم1،2،3. استخدام أنظمة الاستزراع في المختبر راسخ في مجال أبحاث العضلات 4,5. بشكل عام ، في الأنابيب العضلية غير الناضجة المتمايزة في المختبر من الخلايا السلفية العضليةتستخدم 2،6،7،8. على الرغم من إحراز تقدم في بروتوكول التمايز لتوليد ألياف عضلية أكثر نضجا9 ، إلا أن عدم نضجها لا يزال يحد من ترجمة النتائج إلى إعداد في الجسم الحي 1,10. تتمثل إحدى القضايا المركزية في مجال بيولوجيا العضلات في عدم قدرة الأنابيب العضلية المتمايزة في المختبر على تلخيص الهياكل المعقدة داخل الخلايا وعمليات إشارات الخلايا والتفاعلات خارج الخلية التي لوحظت في الأنسجة العضلية الأصلية ، والأهم من ذلك ، تلخيص القوى المقلصة التي تنتجها ألياف العضلات1،2،10،11،12. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يؤدي الانقباض غير المنسق للأنابيب العضلية أثناء عملية التمايز إلى انفصال تلقائي عن أطباق الاستزراع ، مما يجعل التقييم المقلص للأنابيب العضلية المتمايزة في المختبر أمرا صعبا ويقتصر على التقييم النوعي أو شبه الكمي8،11،12،13. غالبا ما تتطلب هذه القيود إجراء تجارب منتظمة في الجسم الحي مع الحيوانات ، خاصة إذا كان انقباض العضلات هو نتيجة تجريبية أولية1.
بديل للزراعة في الأنابيب العضلية المتمايزة في المختبر هو الثقافة خارج الجسم الحي لألياف العضلات الناضجة المعزولة 1,14. أثناء الزراعة خارج الجسم الحي ، يتم استئصال الأنسجة العضلية الناضجة تنمويا خارج الجسم ، تليها عزل خلية واحدة للزراعة في ظروف المختبر1،14. تحافظ ألياف العضلات الناضجة المعزولة على هياكلها الخلوية المعقدة التي لوحظت داخل الأنسجة الأصلية14،15 ، وتفتح هذه الطريقة إمكانية التدخلات المباشرة ، مثل التلاعب الجيني وفحص الأدوية ، في بيئة استزراع محددة جيدا ويمكن التحكم فيها. يعود أحد التقارير الأولى المتعلقة بعزل الألياف العضلية الهيكلية والثقافة خارج الجسم الحي إلى ثلاثينيات القرن العشرين. ومع ذلك ، كان العائد من الألياف القابلة للحياة من هذا البروتوكول منخفضة16. مع التحسين المستمر لإجراء العزل وظروف الاستزراع ، أصبح من الممكن الآن حدوث تحسن كبير في كمية ألياف العضلات القابلة للحياة والوظيفية14،15،17،18،19. أحد هذه التحسينات في ظروف الاستزراع يتضمن طلاء أطباق الاستزراع ببروتينات مصفوفة خارج الخلية لتعزيز التصاق ألياف العضلات المعزولة على طبق الاستزراع15،18،20. عادة ، يتم استخدام طلاء اللامينين ، لأن اللامينين هو أحد أكثر العناصر وفرة داخل مصفوفة العضلاتخارج الخلية 20,21. مكن تحسين إجراء العزل جنبا إلى جنب مع طلاء أطباق الاستزراع مجال أبحاث العضلات من الحفاظ على ألياف عضلية معزولة قابلة للحياة مع بنية خلوية سليمة ووظائف انقباضية في الثقافة لفترات قصيرة من الزمن1،15،18،22.
النهج الأكثر تقليدية المستخدمة في مجال العضلات لقياس القوة وقدرات الانقباض هو تركيب ألياف العضلات الفردية بين محرك محرك الطول ومحول القوة23,24. بشكل عام ، يتم تشريح الألياف العضلية المستخدمة في هذه الإعدادات التي تحركها المحركات إما من الأنسجة المجمدة أو الطازجة ، تليها النفاذية أو “السلخ” ، مما يسمح بتنشيط الكالسيوم الخارجي ، حيث يتم استخدام تركيزات مختلفة من الكالسيوم للحث على تقلص الألياف العضلية24. في حين أن هذه الطريقة هي المعيار الذهبي لقياسات انقباض الألياف العضلية ، يمكن قياس ألياف عضلية واحدة فقط في كل مرة ، مما يجعل هذه التقنية إجراء شاقا ويستغرق وقتا طويلا25. علاوة على ذلك ، فإن إجراء العزل والسلخ للألياف العضلية يعطل الهياكل المختلفة المشاركة في اقتران الإثارة والانكماش (أي إطلاق الكالسيوم وإعادة امتصاصه لاحقا في الشبكة الساركوبلازمية) ، وبالتالي لا يسمح بدراسة حركية الاسترخاء وأي أمراض قد تؤثر على هذه العملية26,27. بديل لإعداد الألياف الجلدية هو استخدام التشريح الميكانيكي لعزل ألياف العضلات السليمة ، حيث يمكن قياس قوى الانقباض استجابة للتنشيط الكهربائي28 ؛ ومع ذلك ، فإن هذا النهج يمثل تحديا تقنيا ويستغرق وقتا طويلا للغاية ، مما يؤدي إلى قياسات منخفضة الإنتاجية. أخيرا ، في كل من المستحضرات الجلدية والسليمة ، تتم إزالة خلايا العضلات تماما من البيئة خارج الخلية أثناء القياسات المقلصة 24 ، مما يجعل التحقيق في تأثير تكوين / تصلب المصفوفة خارج الخلية على تقلص الألياف العضلية مستحيلا24. نتيجة لذلك ، هناك حاجة إلى تطوير طرق بديلة لتمكين قياسات انقباض الألياف العضلية للألياف العضلية السليمة المعزولة بطريقة عالية الإنتاجية مع إعادة إنشاء الاتصال بين ألياف العضلات والمصفوفة خارج الخلية.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نهج جديد قائم على البصريات لقياسات انقباض الألياف العضلية عالية الإنتاجية29. يقيس هذا النظام القائم على البصريات دورية القطع العضلية لتقييم طول القطعة العضلية أثناء الانكماش باستخدام التصوير عالي السرعة. ضمن هذا النظام ، تبقى الخلايا في مكانها في طبق الاستزراع أثناء تحريك البصريات ، وبالتالي تقليل الوقت اللازم بين قياسات الخلاياالمتعددة 29. الميزة الرئيسية لاستخدام هذا النهج عالي الإنتاجية القائم على البصريات هو أنه يسمح بتطوير ظروف استزراع مشابهة لتلك الموجودة في الأنسجة الأصلية. النهج المستخدم لتقليد الظروف الأصلية في الجسم الحي هو تضمين الخلايا في الهلاميات المائية30. عادة ما يكون الهيدروجيل مادة لزجة مرنة قادرة على الحفاظ على حجمها وشكلها ، والهلاميات المائية لها خصائص كل من المواد الصلبة والسائلة31. يتكون الجزء الصلب من سلاسل بوليمر مترابطة مع بعضها البعض ، مما يخلق بنية تشبه الشبكة30,31. يمكن ضبط الخصائص المادية للهلاميات المائية لتقليد ترسب مصفوفة العضلات30,31. وبالتالي ، فإن الجمع بين نظام عالي الإنتاجية قائم على البصريات مع خلايا مدمجة في الهلاميات المائية يفتح إمكانيات جديدة لتقييم آثار تكوين المصفوفة خارج الخلية والخصائص الميكانيكية على وظائف الألياف العضلية.
الهدف العام من هذه الورقة هو 1) وصف منهجية العزل الأنزيمي والزراعة خارج الجسم الحي لألياف العضلات في ظروف تحاكي بيئة الأنسجة الأصلية و 2) تقييم انقباض الألياف العضلية باستخدام نهج عالي الإنتاجية. وصفنا منهجية مفصلة لعزل عدد كبير من الألياف العضلية المفردة بسهولة من العضلة المثنية الرقمية (FDB) باستخدام الهضم الأنزيمي. بالإضافة إلى ذلك ، وصفنا تقنية لتضمين ألياف العضلات المعزولة في هيدروجيل قائم على الفيبرين من أجل محاكاة البيئة الأصلية للعضلات وتحسين صلاحية الألياف العضلية وانقباضها. ثم نحدد طريقة عالية الإنتاجية لقياس تقلصات الألياف العضلية الحية في المختبر باستخدام هذا النظام الذي تم تطويره مؤخرا. ميزة إضافية لإجراء التضمين هذا هي تثبيت الألياف أثناء الانكماش ، مما قد يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء لهذه القياسات. طريقة تضمين الهلام هذه قابلة للتطبيق على كل من إجراءات تغليف البوليمر الفردي والهلام المركب ، مما يسهل تقييم آثار تكوين المصفوفة خارج الخلية على انقباض الألياف العضلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول لأداء العزل الأنزيمي وثقافة ألياف العضلات FDB بتنسيق ثقافة 3D ، تليها قياسات مقلصة باستخدام نظام قياس انقباضي قائم على البصريات. يحتوي هذا البروتوكول على عدد من المزايا ، بما في ذلك 1) عزل مباشر وفي الوقت المناسب للعديد من ألياف العضلات السليمة من عضلة واحدة. 2) تضمين ألياف العضلات في مصفوفة هيدروجيل قابلة للضبط ؛ 3) أداء قياسات الانقباض عالية الإنتاجية باستخدام النظام القائم على البصريات ؛ و 4) القدرة على إجراء قياسات متكررة لنفس الألياف العضلية بعد التدخل. يوفر عزل الألياف العضلية الحية المفردة خلايا عضلية ناضجة تحتفظ بوظيفة انقباضها. نظرا لأن الألياف العضلية التي تم الحصول عليها من الفأر FDB صغيرة نسبيا ، فيمكن التلاعب بها بسهولة أثناء العزل والحفاظ على شكلها المستقيم ، مما يسمح بقياسات انقباض المصب. على الرغم من أن النظام تم تطويره في المقام الأول لدراسة تقلص الخلايا العضلية القلبية ، إلا أن الألياف العضلية الهيكلية تحتوي على نفس الآلية المقلصة مع نمط القطعة العضلية الذي يمكن تمييزه بسهولة ، وبالتالي يمكن قياسه أيضا باستخدام هذا النظام29. يعد اقتران قياسات انقباض الخلية الواحدة مع ثقافة الألياف العضلية الحية خارج الجسم الحي أداة قوية لتقييم صحة الألياف العضلية الناضجة ووظيفتها استجابة للتنشيط الكهربائي.
يتمثل أحد قيود استخدام الألياف العضلية المنفصلة في عدم وجود قوى خارجية (أي التمدد السلبي) المطبقة على الألياف ، مما يؤدي إلى انخفاض أطوال العضل العضلي مقارنة بتلك الموجودة في الجسم الحي. على الرغم من أن طول القطعة العضلية 2.4-2.5 ميكرومتر يضمن الإنتاج الأمثل للقوة، فإن طول القطعة العضلية أثناء الراحة يمكن أن يختلف اختلافا كبيرا33. في حين أن طول القطعة العضلية في الجسم الحي ل FDB لم يتم وصفه بعد ، تشير بياناتنا غير المنشورة إلى متوسط طول يبلغ 2.2 ميكرومتر. تظهر النتائج الحالية متوسط طول القطعة العضلية أثناء الراحة ~ 1.95 ميكرومتر في ألياف FDB غير المحملة بعد 24 ساعة في الاستزراع (الشكل 3). على الرغم من أن طول القطعة العضلية المنخفض هذا سيؤدي إلى انخفاض إنتاج القوة ، إلا أن طول ~ 1.95 ميكرومتر يجب أن ينتج >90٪ من القوة القصوى34. وعلى هذا النحو، يجب أن تكون أطوال القطعة العضلية هذه كافية لتحديد الاختلافات في وظيفة الألياف بين النماذج الجينية المختلفة أو بعد العلاجات الدوائية. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر تضمين الألياف في هيدروجيل العديد من النقاط الإضافية للالتصاق مقارنة بالألياف المستزرعة 2D العائمة ، والتي من شأنها أن تحد من تقصير القطعة العضلية بمرور الوقت.
تتمثل إحدى مزايا بروتوكول عزل الألياف العضلية هذا في استخدام عضلة سريعة الارتعاش سهلة التشريح تتكون من ألياف عضلية صغيرة نسبيا عند مقارنتها بالعضلات الأخرى ، مثل الباسطة الرقمية الطويلة (EDL). حجمها الأصغر يجعل عزل العضلات أكثر ملاءمة للفصل القائم على التثليج ، مما يقلل من فرصة حدوث تلف ناتج عن الماصة أو التشابك لألياف العضلات. يمكن هضم المصفوفة خارج الخلية لعضلات FDB بسهولة إنزيميا باستخدام الكولاجين ، مما يسمح بعزل مئات الألياف العضلية في فترة زمنية قصيرة. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي فرط الهضم إلى تلف ألياف العضلات. يمكن التعرف على فرط هضم ألياف العضلات عندما تنهار العضلات على الفور تقريبا عند تنقيط العضلات أو عندما يتم تقلص نسبة كبيرة من حجم الخلية بشكل مفرط أثناء إجراء بذر الخلايا. لمنع فرط هضم العضلات ، يجب تحسين وقت الهضم لكل دفعة كولاجيناز. لاختبار ذلك ، يجب هضم عضلتين FDB بالتوازي مع وقت هضم متداخل يبلغ 5 دقائق بينهما. يجب اختيار وقت الهضم مع أعلى عائد من ألياف العضلات القابلة للحياة. يجب بعد ذلك إجراء هذا التحسين مرة ثانية ، مرة أخرى مع 5 دقائق من الفصل في وقت الهضم. يجب استخدام وقت الهضم الذي ينتج أعلى ألياف عضلية قابلة للحياة كوقت هضم مثالي للدفعة الحالية من الكولاجيناز. هناك طريقة أخرى للحد من تباين الكولاجيناز من دفعة إلى دفعة وهي حساب وحدات النشاط لكل ملليلتر من محلول المخزون مباشرة ثم إعادة تكوين دفعات كولاجيناز اللاحقة بنفس المقدار. أخيرا ، قد تحتاج أوقات الهضم إلى التحسين عبر سلالات الفئران المختلفة ، على سبيل المثال ، إذا كانت دراسة الحيوانات المسنة أو المريضة التي تظهر زيادة في ترسب المصفوفة خارج الخلية35,36.
إن إمكانية سحب ألياف العضلات المعزولة القابلة للحياة تفتح إمكانيات لاستزراع ألياف العضلات FDB في ظروف الاستزراع المختلفة. أحد هذه الخيارات هو زراعة هذه الألياف في الهلاميات المائية لتقليد بيئة زراعة الأنسجة الأصلية. يضمن بروتوكول التضمين هذا بقاء الألياف في مكانها أثناء القياسات المقلصة وقد تم تحسينها للسماح للألياف بالاستقرار في قاع اللوحة قبل تثبيت الهلام. ومع ذلك ، قد يحتاج هذا البروتوكول إلى التعديل لاستيعاب الاختلافات في مخزون الثرومبين والفيبرينوجين. إذا كان نشاط الثرومبين مرتفعا جدا ، فسوف يتماسك الجل قبل الأوان ، وقد تظل الألياف معلقة في مواقع أعلى خارج المستوى البؤري للمجهر. إذا حدث هذا ، فإن الثرومبين: نسبة الفيبرينوجين تحتاج إلى تعديل. يمكن اختبار ذلك عن طريق طلاء الألياف بتركيزات أقل من الثرومبين بشكل متزايد وملاحظة المدة التي تستغرقها البلمرة. عادة ، لا ينبغي أن يحدث هذا أسرع من 30 دقيقة. ومع ذلك ، فإن وجود تركيز الثرومبين المنخفض جدا قد يضعف أيضا عملية البلمرة. هناك طريقة أخرى للتأكد من أن الألياف في المستوى البؤري الصحيح وهي زرعها أولا باستخدام بروتوكول 2D ثم إضافة طبقة من الهيدروجيل فوق الألياف بعد التصاقها بلوحة الاستزراع. ومع ذلك ، يجب على المرء أن يدرك أن إزالة الوسط من الألياف قد يؤدي إلى فرط الانكماش ، لأنها حساسة للجفاف. كما أنه من غير الواضح ما إذا كان الهيدروجيل سوف يلتصق بالكامل بلوحة الاستزراع ، وقد ينفصل بسهولة أكبر. لذلك ، يفضل إجراء التضمين هذا للحفاظ على الألياف قابلة للحياة وفي مكانها لقياسات الانكماش.
يتيح استخدام هذا البروتوكول دراسة ديناميكيات انقباض ألياف العضلات الناضجة خارج الجسم الحي ويمكن تطبيقه على كل من الفئران السليمة وتلك التي تحمل طفرات جينية للأمراض العضلية. وبالمثل ، فإنه يتيح اختبار كيفية تأثير ظروف الثقافة أو إضافة المركبات على وظيفة الألياف العضلية. تعطي البيانات المقلصة التي تم الحصول عليها باستخدام النظام القائم على البصريات مؤشرا على قدرة انقباض ألياف العضلات المفردة الحية ، ويمكن ربط التغييرات في هذه القدرة بصحة الألياف. ومع ذلك، فإن هذه البيانات وحدها ليست كافية لتحديد ما إذا كانت هذه التغييرات تحدث في مراحل الجسور المتقاطعة للأكتين-الميوسين أو إطلاق الكالسيوم لانقباض العضلات. على الرغم من أننا لا نصف طرق قياس إشارات الكالسيوم في هذا البروتوكول ، إلا أن هذا الإعداد قادر أيضا على قياس عابرات الكالسيوم القائمة على Fura في خلايا العضلاتالمنقبضة 29. عيب هذا النظام هو أن عضلة FDB تحتوي فقط على ألياف عضلية من النوع IIa / IIx سريعة النشل ، والعضلات التي تحتوي على ألياف من النوع الأول بطيئة النشل بهذا الحجم لم يتم وصفها بعد37. هذا يلغي القدرة على دراسة الأداء الخاص بنوع الألياف باستخدام هذه الطريقة. يمكن تكييف البروتوكول الذي نقترحه هنا مع عضلات أخرى مثل EDL أو النعل لدراسة الاختلافات في نوع الألياف. نظرا لحجمها الأكبر ، سيحتاج هذا البروتوكول إلى مزيد من التحسين لهذه العضلات. تميل الألياف الأطول إلى التشابك أثناء خطوة ترسيب الجاذبية وسوف تتمزق إذا تم التلاعب بها عن طريق السحب ، مما قد يؤدي إلى انخفاض الغلة. نظرا لعدم توافقها مع السحب ، فإن الألياف الأطول تكون أيضا أقل توافقا مع تقنية تضمين الهلام. لا يزال من الممكن إجراء قياسات هذه الألياف بتنسيق ثقافة 2D ، ولكن قد تتحرك الألياف أكثر أثناء الانكماش بسبب حجمها ، مما يؤثر على نسبة الإشارة إلى الضوضاء. هناك قيد آخر لهذا النظام وهو عدم القدرة على إجراء قياسات القوة جنبا إلى جنب مع القياسات المقلصة ، مثل قياسات القوة التي يمكن الحصول عليها باستخدام مستحضرات الألياف العضلية السليمة الأخرى28. ومع ذلك ، يمكن التحايل على هذا القيد عن طريق تقدير القوة الناتجة عن الألياف العضلية. يمكن تقدير القوة المتولدة للألياف العضلية إذا كان شكل الألياف العضلية أثناء حالات الانقباض والاسترخاء وكذلك معامل يونغ للمصفوفة معروفا25. ومع ذلك ، يوفر هذا النظام القائم على البصريات نهجا سهل الاستخدام وعالي الإنتاجية لدراسة وظيفة انقباض العضلات ويفتح مجموعة من الاحتمالات الجديدة لدراسة أمراض العضلات الوراثية والتدخلات العلاجية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا سيلفيا بوجاردز وسانا لويجكس وفالنتين يانسن وميشيل هيلمز وإيمي ماندرز على خبرتهم الفنية في المساعدة في تطوير هذا البروتوكول. تم دعم هذا العمل بجوائز من جمعية ضمور العضلات (جائزة التطوير MDA603238 إلى TJK) ، والتحالف الهولندي للقلب والأوعية الدموية (منحة المواهب إلى TJK) ، والمجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC ، أستراليا. زمالة APP1121651 إلى M.Y).
Materials
| Aprotinin, from Bovine Lung | Thermo Scientific | AAJ63039MC | 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Collagenase type 2 | Worthington | 77336 | 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma Aldrich | 50-176-5054 | 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413201 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Gibco MEM High glucose + pyruvate | Thermo Fisher | 11095080 | |
| Horse serum | Thermo Fisher | H1270 | |
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Serum Replacement 2 (50x) | Sigma Aldrich | S9388 | |
| Thrombin, Bovine Plasma | Thermo Scientific | AAJ63383EXP | 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Tranexamic Acid | Thermo Scientific | AC228042500 | 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Equipment | |||
| 24-well electrical stimulator | IonOptix | N/a | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| MultiCell Cytocypher | IonOptix | N/a | |
| MyoCam-S3 | IonOptix | N/a | |
| MyoPacer | IonOptix | N/a | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent | Dow corning | N/a | |
| Vannas Spring Scissor – 25 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Software | |||
| CytoSolver | IonOptix | N/a | |
| IonWizard | IonOptix | N/a |
References
- Smith, L. R., Meyer, G. A. Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment. Connective Tissue Research. 61 (3-4), 248-261 (2020).
- Khodabukus, A., Prabhu, N., Wang, J., Bursac, N. In vitro tissue-engineered skeletal muscle models for studying muscle physiology and disease. Advanced Healthcare Materials. 7 (15), 1701498 (2018).
- Fernandez-Costa, J. M., Fernandez-Garibay, X., Velasco-Mallorqui, F., Ramon-Azcon, J. Bioengineered in vitro skeletal muscles as new tools for muscular dystrophies preclinical studies. Journal of Tissue Engineering. 12, 2041731420981339 (2021).
- Romagnoli, C., Iantomasi, T., Brandi, M. L. Available in vitro models for human satellite cells from skeletal muscle. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13221 (2021).
- Dessauge, F., Schleder, C., Perruchot, M. -. H., Rouger, K. 3D in vitro models of skeletal muscle: Myopshere, myobundle and bioprinted muscle construct. Veterinary Research. 52 (1), 72 (2021).
- Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle. Cell Biology International. 37 (2), 191-196 (2013).
- Guo, X., et al. In vitro differentiation of functional human skeletal myotubes in a defined system. Biomaterials Science. 2 (1), 131-138 (2014).
- Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
- Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In vitro differentiation of mature myofibers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
- Khodabukus, A. Tissue-engineered skeletal muscle models to study muscle function, plasticity, and disease. Frontiers in Physiology. 12, 619710 (2021).
- Engler, A. J., et al. Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: Pathological implications for soft or stiff microenvironments. Journal of Cell Biology. 166 (6), 877-887 (2004).
- Huang, N. F., et al. Myotube assembly on nanofibrous and micropatterned polymers. Nano Letters. 6 (3), 537-542 (2006).
- Earle, A. J., et al. Mutant lamins cause nuclear envelope rupture and DNA damage in skeletal muscle cells. Nature Materials. 19 (4), 464-473 (2020).
- Stange, K., Ahrens, H. E., von Maltzahn, J., Rontgen, M. Isolation and ex vivo cultivation of single myofibers from porcine muscle. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 56 (8), 585-592 (2020).
- Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system–A more mature muscle culture system. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
- Ramsey, R. W., Street, S. F. The isometric length-tension diagram of isolated skeletal muscle fibers of the frog. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 15 (1), 11-34 (1940).
- Selvin, D., Hesse, E., Renaud, J. M. Properties of single FDB fibers following a collagenase digestion for studying contractility, fatigue, and pCa-sarcomere shortening relationship. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), R467-R479 (2015).
- Renzini, A., et al. Culture conditions influence satellite cell activation and survival of single myofibers. European Journal of Translational Myology. 28 (2), 7567 (2018).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Holmberg, J., Durbeej, M. Laminin-211 in skeletal muscle function. Cell Adhesion and Migration. 7 (1), 111-121 (2013).
- Stuelsatz, P., Keire, P., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation, culture, and immunostaining of skeletal muscle myofibers from wildtype and nestin-GFP mice as a means to analyze satellite cell. Methods in Molecular Biology. 1556, 51-102 (2017).
- Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
- Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
- Ottenheijm, C. A., et al. Altered myofilament function depresses force generation in patients with nebulin-based nemaline myopathy (NEM2). Journal of Structural Biology. 170 (2), 334-343 (2010).
- Rausch, M., et al. Measurement of skeletal muscle fiber contractility with high-speed traction microscopy. Biophysical Journal. 118 (3), 657-666 (2020).
- de Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 754-767 (2020).
- Wijnker, P. J. M., vander Velden, J. Mutation-specific pathology and treatment of hypertrophic cardiomyopathy in patients, mouse models and human engineered heart tissue. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1866 (8), 165774 (2020).
- Cheng, A. J., Westerblad, H. Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca(2+)] in fully intact single skeletal muscle fibers. Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).
- Cao, L., Manders, E., Helmes, M. Automatic detection of adult cardiomyocyte for high throughput measurements of calcium and contractility. PLoS One. 16 (9), e0256713 (2021).
- Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2010).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical Research. 26 (3), 631-643 (2009).
- Cold Spring Harbor Protocols. Sylgard-coated coverslips and petri dishes. Cold Spring Harbor Protocols. 2022 (8), (2022).
- Moo, E. K., Fortuna, R., Sibole, S. C., Abusara, Z., Herzog, W. In vivo sarcomere lengths and sarcomere elongations are not uniform across an intact muscle. Frontiers in Physiology. 7, 187 (2016).
- Moo, E. K., Leonard, T. R., Herzog, W. The sarcomere force-length relationship in an intact muscle-tendon unit. Journal of Experimental Biology. 223, 215020 (2020).
- Schuler, S. C., et al. Extensive remodeling of the extracellular matrix during aging contributes to age-dependent impairments of muscle stem cell functionality. Cell Reports. 35 (10), 109223 (2021).
- Carberry, S., Zweyer, M., Swandulla, D., Ohlendieck, K. Proteomics reveals drastic increase of extracellular matrix proteins collagen and dermatopontin in the aged mdx diaphragm model of Duchenne muscular dystrophy. International Journal of Molecular Medicine. 30 (2), 229-234 (2012).
- Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skeletal Muscle. 8 (1), 14 (2018).
