초파리에서 운동 활동을 분석하는 간단한 기술
Summary
현재 프로토콜은 속도, 거리 등의 매개변수를 계산하기 위해 고화질 비디오 녹화를 기반으로 각 프레임의 픽셀을 분할하는 플러그인과 호환되는 오픈 소스 소프트웨어 피지를 사용하여 손으로 만든 경기장에서 파리의 움직임을 추적 및 분석하여 초파리 의 운동 활동을 평가합니다.
Abstract
Drosophila melanogaster 는 풍부한 고급 유전자 조작 기술과 다양한 행동 특징으로 인해 다양한 질병을 연구하는 데 이상적인 모델 유기체입니다. 동물 모델에서 행동 결함을 식별하는 것은 예를 들어 환자가 종종 운동 기능 장애를 경험하는 신경퇴행성 질환에서 질병 중증도의 중요한 척도입니다. 그러나 약물 치료 또는 형질전환 개체와 같은 비행 모델의 운동 결함을 추적하고 평가할 수 있는 다양한 시스템을 사용할 수 있기 때문에 여러 각도에서 정확한 평가를 위한 경제적이고 사용자 친화적인 시스템이 여전히 부족합니다. 피지 이미지 처리 프로그램과 호환되는 AnimalTracker 응용 프로그래밍 인터페이스(API)를 기반으로 하는 방법이 여기에서 개발되어 녹화된 비디오에서 성충과 애벌레 개체의 움직임 활동을 체계적으로 평가하여 추적 행동을 분석할 수 있습니다. 이 방법은 행동을 기록하고 분석하기 위해 고화질 카메라와 컴퓨터 주변 장치 하드웨어 통합만 필요하므로 형질전환 또는 환경적 행동 결함이 있는 파리 모델을 선별하는 데 저렴하고 효과적인 접근 방식입니다. 약리학적으로 처리된 파리를 사용한 행동 테스트의 예는 기술이 성충 파리와 유충 모두의 행동 변화를 매우 반복 가능한 방식으로 감지할 수 있는 방법을 보여주기 위해 제공됩니다.
Introduction
초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)는 유전자 변형(gene modification)1, 약물 치료(drug treatment)2, 노화(sagingence)3에 의해 생성된 뉴런 질환 모델에서 세포 및 분자 기능을 조사하기 위한 우수한 모델 유기체를 제공한다. 인간과 초파리 사이의 생물학적 경로, 물리적 특성 및 질병 관련 상동체 유전자의 높은 보존은 초파리를 분자에서 행동 수준까지 이상적인 모방체로 만듭니다4. 많은 질병 모델에서, 행동 결핍은 다양한 인간 신경병증에 대한 유용한 모델을 제공하는 중요한 지표이다 5,6. 초파리는 현재 파킨슨병 및 근위축성 측삭 경화증과 같은 여러 인간 질병, 신경 발달 및 신경퇴행성 질환을 연구하는 데 사용됩니다 7,8. 질병 모델의 운동 능력을 감지하는 것은 병원성 진행을 이해하는 데 중요하며 질병 과정의 기초가 되는 분자 메커니즘에 대한 표현형 상관관계를 제공할 수 있습니다.
최근에, 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어 도구 및 비용 효율적인 프로그램이 초파리 운동 탐지 전략을 위해 개발되었는데, 예를 들어 그룹화된 파리 9,10에서의 고처리량 테스트 및 실시간운동 측정(11,12)과 같은 것이다. 이러한 전통적인 접근법 중 하나는 등반 분석이라고도하는 신속한 상호 작용 음성 지오 택시 (RING)로, 동일한 성별과 연령을 가진 많은 파리 개체군을 포함 할 수있는 다중 채널을 포함하여 데이터를 수집하는 동안 변동을 줄입니다 9,13. 운동 거동을 분석하기 위한 또 다른 사전 테스트 방법은 TriKinetics 초파리 활동 모니터(DAM)이며, 이 장치는 얇은 유리관(14) 내에서 비행 활동 이동을 검출하기 위해 다중 빔을 사용하는 장치이다. 이 장치는 위치를 지속적으로 기록하는데, 이는 장기간에 걸쳐 파리의 활동과 일주기 리듬을 연구하기 위해 빔 교차를 계산하여 자동화된 이동을 나타냅니다15. 이러한 방법은 행동 운동의 변화를 결정하기 위해 초파리의 행동 결함을 분석하는 데 널리 사용되었지만 항상 특수 테스트 장비 또는 복잡한 분석 프로세스가 필요하며 제한적이고 간단한 장치로 일부 모델에서는 적용을 제한합니다. FlyGrAM11 및 Drosophila island assay10과 같은 성체 초파리를 테스트하기 위한 동물 추적 그룹 기반 전략은 사전 정의된 영역에서 사회적 모집 및 개별 추적을 구현합니다. 그럼에도 불구하고, 반항적인 지역에서의 사회적 개별적 제한은 파리의 충돌 또는 겹침으로 인해 이미지의 식별에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. TRex16, MARGO 12 및 FlyPi17과 같은 일부 오픈 소스 재료 기반 방법은 비상 사태가 발생하더라도 행동 테스트에서 유연한 사용으로 파리를 빠르게 추적할 수 있습니다. 이러한 테스트 접근 방식은 정교한 실험 장치 설치, 특수 소프트웨어 요구 사항 또는 전문 컴퓨터 언어와 관련이 있습니다. 유충의 경우, 단위 시간당 격자 경계선의 수를 가로질러 이동한 총 거리를 측정하거나18 개체의 체벽 수축을 수동으로 대략적으로 세는 것19이 운동 능력을 평가하는 주된 방법이다. 장비나 장치 및 분석 방법의 정밀도가 부족하기 때문에 유충의 일부 행동 운동은 탐지되지 않아 행동 움직임, 특히 미세한 움직임을 정확하게 평가하기 어렵다15.
현재 개발된 방법은 피지(ImageJ) 영상 처리 프로그램과 호환되는 AnimalTracker 응용 프로그래밍 인터페이스(API)를 활용하여 고화질(HD) 비디오에서 추적 행동을 분석하여 성충 파리와 유충 파리의 운동 활동을 체계적으로 평가합니다. Fiji는 강력한 소프트웨어 라이브러리와 수많은 스크립팅 언어를 결합할 수 있는 오픈 소스 소프트웨어 ImageJ 배포판으로, 이미지 처리 알고리즘의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 하여 이미지 분석 기능으로 생물학자들 사이에서 인기가 있습니다(20). 현재 접근 방식에서 피지의 AnimalTracker API에 대한 통합은 개인화된 알고리즘 삽입을 통해 고유한 초파리 행동 분석을 개발하는 데 활용되며, 운동 행동의 강력한 분석 기능을 지원하기 위한 자세한 문서 및 자습서를 위한 유용한 단계를 제공합니다(그림 1). 파리의 충돌 또는 겹침으로 인한 이미지에서 객관적인 식별의 복잡성을 피하기 위해 각 경기장은 단 하나의 파리만 호스팅하도록 제한됩니다. 접근법의 추적 정밀도를 평가한 결과, 파킨슨병의 동물 모델에 일반적으로 사용되는 독성 약물 로테논과 함께 투여된 초파리 의 운동 운동을 추적하고 정량화하여 궁극적으로 약물 치료에서 운동 장애를 발견하기 위해 구현되었습니다21. 오픈 소스 및 자유 소프트웨어를 사용하는 이 방법론은 고비용의 계측을 필요로 하지 않으며 초파리 행동 운동을 정확하고 재현 가능하게 분석할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 피지 이미지 처리 프로그램과 호환되는 오픈 소스 자료 AnimalTracker API를 기반으로 연구자들이 성충 파리와 개별 유충 파리를 모두 추적하여 운동 활동을 체계적으로 평가할 수 있는 방법을 설계했습니다. AnimalTracke 는 자바로 작성된 도구로, 애플리케이션-설계된 동물 추적 행동의 분석을 용이하게 하기 위해 기존 데이터베이스 또는 다른 툴에 쉽게 통합될 수 있다<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Soochow University와 중국 국립 과학 재단 (NSFC) (82171414)의 특별 출시 기금으로 지원되었습니다. Chunfeng Liu 교수의 연구실 구성원들의 토론과 의견에 감사드립니다.
Materials
| Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
| Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
| Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
| Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
| Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
| Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
| Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
| Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
| Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
| Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
| Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
| Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |
References
- Ham, S. J., et al. Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson’s disease by suppressing glycolysis. Science Advances. 7 (28), (2021).
- Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster. Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).
- Yamaguchi, M., Yoshida, H. Drosophila as a model organism. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).
- Rothenfluh, A., Heberlein, U. Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion. Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).
- Tsuda, L., Lim, Y. M. Alzheimer’s disease model system using Drosophila. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).
- Dung, V. M., Thao, D. T. P. Parkinson’s disease model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 41-61 (2018).
- Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).
- Cao, W., et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (127), 56507 (2017).
- Eidhof, I., et al. High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay. Journal of Visualized Experiments. (129), 55892 (2017).
- Scaplen, K. M., et al. Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 9 (1), 4427 (2019).
- Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology. PLoS One. 14 (11), e0224243 (2019).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
- Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).
- McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. 98, e52684 (2015).
- Walter, T., Couzin, I. D. TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields. eLife. 10, (2021).
- Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), e2002702 (2017).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Xiao, G. Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study. Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. An update on the rotenone models of Parkinson’s disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions. Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson’s disease in Drosophila melanogaster. The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).
- Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892 (2022).
- Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program. Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).
- Qu, S. EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665 (2022).
- Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python. International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).
