Een eenvoudige techniek om locomotorische activiteit in Drosophila te testen

Drosophila melanogaster biedt een uitstekend modelorganisme voor het onderzoeken van cellulaire en moleculaire functies in neuronale ziektemodellen gemaakt door genmodificatie¹, medicamenteuze behandeling² en senescentie³. Het hoge behoud van biologische routes, fysieke eigenschappen en ziekte-geassocieerde homologe genen tussen mensen en Drosophila maakt de fruitvlieg een ideale nabootsing van het moleculaire naar het gedragsniveau⁴. In veel ziektemodellen is gedragsdeficiëntie een belangrijke index, die een nuttig model biedt voor verschillende menselijke neuropathieën ^5,6. Drosophila wordt nu gebruikt om meerdere menselijke ziekten, neurologische ontwikkeling en neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson en amyotrofische laterale sclerose te bestuderen ^7,8. Het detecteren van het motorisch vermogen van de ziektemodellen is cruciaal voor het begrijpen van de pathogene vooruitgang en kan een fenotypische correlatie bieden met de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het ziekteproces.

Onlangs zijn commercieel beschikbare softwaretools en kosteneffectieve programma’s ontwikkeld voor Drosophila locomotorische detectiestrategieën, zoals high-throughput testen in gegroepeerde vliegen 9,10 en het meten van voortbeweging in real-time^11,12. Een dergelijke conventionele benadering is snelle interactieve negatieve geotaxis (RING), ook wel de klimtest genoemd, die meerdere kanalen omvat waarmee een grote vliegenpopulatie met hetzelfde geslacht en dezelfde leeftijd kan worden ingeperkt, waardoor variatie wordt verminderd terwijl gegevens ^{9,13 worden verzameld}. Een andere pre-testmethode voor het analyseren van locomotorisch gedrag is TriKinetics Drosophila activity monitor (DAM), een apparaat dat meerdere bundels gebruikt om vliegactiviteitsbewegingen in een dunne glazen buis^{te detecteren 14}. Het apparaat registreert continu de positie, wat de geautomatiseerde voortbeweging vertegenwoordigt door de balkkruisingen te berekenen om de activiteit en het circadiane ritme van vliegen over een langere periode te bestuderen¹⁵. Hoewel deze methoden op grote schaal zijn gebruikt bij het analyseren van gedragsdefecten bij fruitvliegen om veranderingen in gedragsvoortbeweging te bepalen, vereisen ze altijd speciale testapparatuur of complexe analyseprocessen en beperken ze hun toepassing in sommige modellen met een beperkt, eenvoudig apparaat. Diertraceringsgroepgebaseerde strategieën voor het testen van de volwassen Drosophila, zoals FlyGrAM¹¹ en de Drosophila-eilandtest ¹⁰, implementeren sociale rekrutering en individuele tracking in een vooraf gedefinieerd gebied. Niettemin kan sociale individuele beperking in getrotseerde gebieden een negatief effect hebben op identificaties in de beelden, veroorzaakt door de botsing of overlapping van vliegen. Hoewel sommige op open-source materialen gebaseerde methoden, zoals TRex¹⁶, MARGO 12 en FlyPi¹⁷, een noodgeval hebben, kunnen ze de vliegen snel traceren met flexibel gebruik in gedragstests. Deze testbenaderingen worden geassocieerd met uitgebreide experimentele apparaatinstallaties, speciale softwarevereisten of professionele computertalen. Voor larven zijn het meten van de totale afgelegde afstand over het aantal rastergrenslijnen per tijdseenheid¹⁸, of het ruw tellen van de lichaamswandcontracties voor individuen handmatig¹⁹, de belangrijkste methoden om hun motorische vermogen te beoordelen. Vanwege het gebrek aan precisie in apparatuur of apparaten en analysemethoden, kan enige gedragsbeweging van larven aan detectie ontsnappen, waardoor het moeilijk wordt om gedragsbewegingen nauwkeurig te beoordelen, vooral fijne beweging¹⁵.

De huidige ontwikkelde methode maakt gebruik van de AnimalTracker application programming interface (API), compatibel met het Fiji (ImageJ) beeldverwerkingsprogramma, om systematisch de locomotorische activiteit van zowel volwassen als larvale vliegen te evalueren door hun trackinggedrag van high-definition (HD) video’s te analyseren. Fiji is een open-source software ImageJ-distributie die robuuste softwarebibliotheken kan combineren met tal van scripttalen, wat resulteert in snelle prototyping van beeldverwerkingsalgoritmen, waardoor het populair is bij biologen vanwege de beeldanalysemogelijkheden²⁰. In de huidige aanpak wordt de integratie van Fiji in de AnimalTracker API gebruikt om een unieke Drosophila-gedragstest te ontwikkelen met gepersonaliseerde algoritme-invoeging, en biedt een nuttige stap voor gedetailleerde documentatie en tutorials ter ondersteuning van robuuste analytische mogelijkheden van locomotorisch gedrag (figuur 1). Om de complicatie van objectieve identificaties in de beelden veroorzaakt door de botsing of overlapping van vliegen te omzeilen, is elke arena beperkt tot het hosten van slechts één vlieg. Na het beoordelen van de trackingprecisie van de aanpak, werd het geïmplementeerd om de locomotorische bewegingen van Drosophila te traceren en te kwantificeren die werden toegediend met het toxische medicijn rotenon, dat over het algemeen wordt gebruikt voor diermodellen van de ziekte van Parkinson, en uiteindelijk locomotiestoornissen ontdekte in de medicamenteuze behandeling²¹. Deze methodologie, die open-source en vrije software gebruikt, vereist geen dure instrumentatie en kan de gedragsbeweging van Drosophila nauwkeurig en reproduceerbaar analyseren.