וסקולריזציה יעילה של אורגנואידים בכליות באמצעות השתלה אינטרסלומית בעוברי תרנגולות
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להשתלת אורגנואידים בכליות בחלל הצלומי של עוברי תרנגולות. שיטה זו גורמת לכלי דם ולהבשלה משופרת של האורגנואידים תוך 8 ימים וניתן להשתמש בה כדי ללמוד תהליכים אלה בצורה יעילה.
Abstract
אורגנואידים בכליות שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מכילים מבנים דמויי נפרון הדומים במידה מסוימת לאלה שבכליה הבוגרת. למרבה הצער, היישום הקליני שלהם נפגע על ידי היעדר כלי דם תפקודי וכתוצאה מכך הבשלה מוגבלת במבחנה. השתלת אורגנואידים בכליות בחלל הצלומי של עוברי תרנגולות גורמת לכלי דם מחוררים, כולל היווצרות נימים גלומרולריים, ומשפרת את התבגרותם. טכניקה זו יעילה מאוד, ומאפשרת השתלה וניתוח של מספר רב של אורגנואידים. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט להשתלה אטרקלומית של אורגנואידים בכליות בעוברי תרנגולות, ואחריו הזרקת לקטין מסומן פלואורסצנטית כדי להכתים את כלי הדם המחוררים, ואיסוף אורגנואידים מושתלים לניתוח הדמיה. שיטה זו יכולה לשמש כדי לגרום ולחקור כלי דם אורגנואידים והתבגרות כדי למצוא רמזים לשיפור תהליכים אלה במבחנה ולשפר מודלים של מחלות.
Introduction
אורגנואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC) הוכחו כבעלי פוטנציאל למחקרים התפתחותיים 1,2,3,4, בדיקת רעילות 5,6 ומידול מחלות5,7,8,9,10,11,12,13. עם זאת, תחולתם למטרות השתלה קלינית אלה ובסופו של דבר מוגבלת על ידי היעדר רשת כלי דם. במהלך התפתחות הכליות העובריות, פודוציטים, תאים מזנגיאליים ותאי אנדותל וסקולריים (ECs) מתקשרים כדי ליצור את המבנה המורכב של הגלומרולוס. ללא אינטראקציה זו, מחסום הסינון הגלומרולרי, המורכב מפודוציטים, קרום המרתף הגלומרולרי (GBM) ו- ECs, אינו יכול להתפתח כראוי14,15,16. למרות שאורגנואידים במבחנה בכליות מכילים כמה ECs, אלה אינם מצליחים ליצור רשת כלי דם תקינה ופוחתים עם הזמן17. לכן אין זה מפתיע שהאורגנואידים נותרים לא בשלים. השתלה בעכברים גורמת לכלי דם ולהבשלה של אורגנואידי הכליה 18,19,20,21. למרבה הצער, זהו תהליך עתיר עבודה שאינו מתאים לניתוח של מספר רב של אורגנואידים.
עוברי תרנגולות שימשו לחקר כלי דם והתפתחות במשך יותר ממאה שנה22. הם נגישים בקלות, דורשים תחזוקה נמוכה, חסרים מערכת חיסונית מתפקדת במלואה, ויכולים להתפתח באופן תקין לאחר פתיחת קליפת הביצה 23,24,25,26. השתלת אורגנואידים על הממברנה הכוריואלנטית שלהם (CAM) הוכחה כמובילה לכלי דם27. עם זאת, משך ההשתלה על CAM, כמו גם את רמת ההבשלה של השתל, מוגבלים על ידי היווצרות CAM, אשר לוקח עד יום 7 העוברי כדי להשלים. לכן, פותחה לאחרונה שיטה לכלי דם יעילים ולהבשיל אורגנואידים בכליה באמצעות השתלה אטרסלומית בעוברי תרנגולות28. החלל הצלומי של עוברי תרנגולות ידוע מאז שנות השלושים כסביבה נוחה להתמיינות רקמות עובריות29,30. ניתן לגשת אליו בשלב מוקדם של ההתפתחות העוברית ומאפשר הרחבה בלתי מוגבלת יחסית של השתל לכל הכיוונים.
מאמר זה מתאר פרוטוקול להשתלת אורגנואידים שמקורם בכליות hiPSC בחלל הצלומי של עוברי תרנגולות ביום 4. שיטה זו גורמת לכלי דם ולהבשלה משופרת של האורגנואידים תוך 8 ימים. הזרקת עדשה בעלת תווית פלואורסצנטית culinaris agglutinin (LCA) לפני הקרבת העוברים מאפשרת הדמיה של כלי דם מחוררים בתוך האורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
Protocol
Representative Results
Discussion
בכתב יד זה מודגם פרוטוקול להשתלה אינטרטלומית של אורגנואידים שמקורם ב-hiPSC בעוברי תרנגולות. עם ההשתלה, אורגנואידים הם כלי דם על ידי כלי דם מחוררים המורכבים משילוב של ECs שמקורם באורגנואידים אנושיים ומקורם בעוף. אלה מפוזרים ברחבי האורגנואיד ופולשים למבנים הגלומרולריים, ומאפשרים אינטראקציה ב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לג’ורג’ גאלריס (LUMC, ליידן, הולנד) על עזרתו בהזרקת עובר תרנגולת. אנו מודים על תמיכתם של ססקיה ואן דר וול-מאס (המחלקה לאנטומיה ואמבריולוגיה, LUMC, ליידן, הולנד), קוני ואן מינסטרן (המחלקה לאנטומיה ואמבריולוגיה, LUMC, ליידן, הולנד), מאנון זורמונד (LUMC, ליידן, הולנד) ואנמארי דה גראף (LUMC, ליידן, הולנד). M. Koning נתמך על ידי ‘Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC’. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרן אוניברסיטת ליידן “Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund” GWF2019-02. עבודה זו נתמכת על ידי השותפים של רפואה רגנרטיבית חוצה גבולות (RegMedXB) ובריאות הולנד, מגזר עליון, מדעי החיים ובריאות. C.W. van den Berg ו- T.J. Rabelink נתמכים על ידי מרכז קרן נובו נורדיסק לרפואת תאי גזע (reNEW), מרכז קרן נובו נורדיסק לרפואת תאי גזע נתמך על ידי מענקי קרן נובו נורדיסק (NNF21CC0073729).
Materials
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
References
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).
- Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).
- Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
- Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
- Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).
- Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).
- Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
- Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
- Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
- vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
- Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
- vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
- Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
- Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
- Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
- Rawles, M. E. Transplantation of normal embryonic tissues. Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).
- Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
- Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).
- Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
- Dossel, W. E. New method of intracelomic grafting. Science. 120 (3111), 262-263 (1954).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
- . ACUC. Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).
