الأوعية الدموية الفعالة لعضويات الكلى من خلال زرع Inenterlomic في أجنة الدجاج
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لزرع عضويات الكلى في التجويف السيلومي لأجنة الدجاج. تحفز هذه الطريقة الأوعية الدموية والنضج المعزز للعضويات في غضون 8 أيام ويمكن استخدامها لدراسة هذه العمليات بطريقة فعالة.
Abstract
تحتوي عضويات الكلى المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان على هياكل تشبه النيفرون تشبه تلك الموجودة في الكلى البالغة إلى حد ما. لسوء الحظ ، فإن قابليتها للتطبيق السريري يعوقها عدم وجود الأوعية الدموية الوظيفية وبالتالي النضج المحدود في المختبر. إن زرع عضويات الكلى في التجويف السيلومي لأجنة الدجاج يحفز الأوعية الدموية عن طريق الأوعية الدموية المثقوبة ، بما في ذلك تكوين الشعيرات الدموية الكبيبية ، ويعزز نضجها. هذه التقنية فعالة للغاية ، مما يسمح بزرع وتحليل أعداد كبيرة من المواد العضوية. تصف هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للزرع الداخلي لعضويات الكلى في أجنة الدجاج ، يليه حقن الليكتين المسمى بالفلورسنت لتلطيخ الأوعية الدموية المثقوبة ، وجمع المواد العضوية المزروعة لتحليل التصوير. يمكن استخدام هذه الطريقة للحث على دراسة الأوعية الدموية العضوية والنضج للعثور على أدلة لتعزيز هذه العمليات في المختبر وتحسين نمذجة المرض.
Introduction
لقد ثبت أن عضويات الكلى المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSC) لديها إمكانات للدراسات التنموية1،2،3،4 ، وفحص السمية 5،6 ، ونمذجة المرض5،7،8،9،10،11،12،13. ومع ذلك ، فإن قابليتها للتطبيق لهذه الأغراض وأغراض الزرع السريري في نهاية المطاف محدودة بسبب عدم وجود شبكة الأوعية الدموية. أثناء نمو الكلى الجنينية ، تتفاعل الخلايا القلبية والخلايا المتوسطة والخلايا البطانية الوعائية (ECs) لتشكيل البنية المعقدة للكبيبة. بدون هذا التفاعل ، لا يمكن أن يتطور حاجز الترشيح الكبيبي ، الذي يتكون من الخلايا الدموية ، والغشاء القاعدي الكبيبي (GBM) ، و ECs ، بشكل صحيح14،15،16. على الرغم من أن عضويات الكلى في المختبر تحتوي على بعض ECs ، إلا أنها تفشل في تكوين شبكة أوعية دموية مناسبة وتتضاءل بمرور الوقت17. لذلك ليس من المستغرب أن تظل الكائنات العضوية غير ناضجة. زرع في الفئران يحفز الأوعية الدموية ونضوج عضويات الكلى18،19،20،21. لسوء الحظ ، هذه عملية كثيفة العمالة وغير مناسبة لتحليل أعداد كبيرة من المواد العضوية.
تم استخدام أجنة الدجاج لدراسة الأوعية الدموية وتطورها لأكثر منقرن 22. يمكن الوصول إليها بسهولة ، وتتطلب صيانة منخفضة ، وتفتقر إلى نظام مناعي يعمل بكامل طاقته ، ويمكن أن تتطور بشكل طبيعي بعد فتح قشر البيض23،24،25،26. ثبت أن زرع المواد العضوية على الغشاء المشيمي الولعي (CAM) يؤدي إلى الأوعية الدموية27. ومع ذلك ، فإن مدة الزرع على CAM ، وكذلك مستوى نضوج الكسب غير المشروع ، محدودة بتكوين الطب التكميلي والبديل ، والذي يستغرق حتى اليوم الجنيني 7 حتى يكتمل. لذلك ، تم تطوير طريقة مؤخرا لكفاءة الأوعية الدموية وعضويات الكلى الناضجة من خلال زرع inenterlomic في أجنة الدجاج28. من المعروف أن التجويف السيلومي لأجنة الدجاج منذ ثلاثينيات القرن العشرين هو بيئة مواتية لتمايز الأنسجة الجنينية29,30. يمكن الوصول إليه في وقت مبكر من التطور الجنيني ويسمح بتوسع غير محدود نسبيا للكسب غير المشروع في جميع الاتجاهات.
تحدد هذه الورقة بروتوكولا لزرع عضويات الكلى المشتقة من hiPSC في التجويف السيلومي لأجنة الدجاج في اليوم 4. هذه الطريقة تحفز الأوعية الدموية وتعزيز نضوج المواد العضوية في غضون 8 أيام. يتيح حقن عدسة كوليناريس أغلوتينين (LCA) ذات العلامات الفلورية قبل التضحية بالأجنة تصور الأوعية الدموية المثقوبة داخل المواد العضوية من خلال الفحص المجهري متحد البؤر.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة ، تم عرض بروتوكول للزرع داخل المخ لعضويات الكلى المشتقة من hiPSC في أجنة الدجاج. عند الزرع ، يتم الأوعية الدموية العضوية بواسطة الأوعية الدموية المثقوبة التي تتكون من مزيج من ECs المشتقة من الأعضاء البشرية والمشتقة من الدجاج. تنتشر هذه في جميع أنحاء العضوية وتغزو الهياكل الكبي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جورج غالاريس (LUMC ، ليدن ، هولندا) على مساعدته في حقن أجنة الدجاج. نحن نعترف بدعم ساسكيا فان دير وال ماس (قسم التشريح وعلم الأجنة ، LUMC ، ليدن ، هولندا) ، كوني فان مونستيرين (قسم التشريح وعلم الأجنة ، LUMC ، ليدن ، هولندا) ، مانون زورموند (LUMC ، ليدن ، هولندا) ، وآن ماري دي غراف (LUMC ، ليدن ، هولندا). M. Koning مدعوم من قبل ‘Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC’. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل صندوق جامعة ليدن “صندوق البروفيسور ياب دي جراف لينجلينج ويادهانرما” GWF2019-02. يتم دعم هذا العمل من قبل شركاء الطب التجديدي عبر الحدود (RegMedXB) و Health Holland ، أعلى قطاع علوم الحياة والصحة. يتم دعم C.W. van den Berg و T.J. Rabelink من قبل مركز مؤسسة نوفو نورديسك لطب الخلايا الجذعية (reNEW) ، ويتم دعم مركز مؤسسة نوفو نورديسك لطب الخلايا الجذعية من خلال منح مؤسسة نوفو نورديسك (NNF21CC0073729).
Materials
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
References
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).
- Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).
- Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
- Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
- Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).
- Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).
- Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
- Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
- Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
- vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
- Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
- vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
- Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
- Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
- Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
- Rawles, M. E. Transplantation of normal embryonic tissues. Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).
- Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
- Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).
- Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
- Dossel, W. E. New method of intracelomic grafting. Science. 120 (3111), 262-263 (1954).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
- . ACUC. Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).
