Ensaio de Captação de Anticorpos para Rastreamento de Endocitose Notch/Delta Durante a Divisão Assimétrica de Progenitores da Glia Radial de Zebrafish

A sinalização Notch controla a decisão e padronização do destino celular durante o desenvolvimento em metazoários¹, e estudos recentes têm mostrado que a sinalização Notch na divisão de células-tronco depende principalmente do tráfego endocítico ^2,3. O Notch endocitosado/Delta pode ativar a sinalização Notch no núcleo e aumentar a transcrição de genes alvo Notch ^4,5,6. O tráfego endossômico Notch/Delta direcional foi observado pela primeira vez em células precursoras de órgãos sensoriais (SOP) de Drosophila durante sua divisão celular assimétrica (ACD), resultando em uma maior atividade de sinalização Notch em pIIa do que em pIIb ^7,8. Ensaios de captação de anticorpos com anticorpos anti-Delta e anti-Notch têm sido aplicados para monitorar o processo endocítico em células POP mitóticas. Os endossomos Notch/DeltaD movem-se juntamente com uma proteína motora de cinesina para o fuso central durante a citocinese, e são translocados assimetricamente para dentro da célula pIIa devido à matriz antiparalela do fuso central assimétrico no último momento da divisão celular ^3,8. Esses estudos lançaram luz sobre os mecanismos moleculares que regulam a divisão assimétrica em células de Drosophila SOP, mas não está claro se processos endocíticos semelhantes ocorrem em progenitores da glia radial de vertebrados (RGPs).

Além disso, os mecanismos moleculares que regulam a sinalização assimétrica Notch/DeltaD durante a divisão do RGP dos vertebrados não são bem compreendidos. Em zebrafish, tem sido relatado que a interação de Notch e Delta facilita a endocitose do ligante DeltaD⁹. Não se sabe se a endocitose DeltaD pode afetar a escolha do destino celular das células filhas no cérebro de vertebrados em desenvolvimento. Estudos recentes mostram que a injeção de anticorpos anti-DeltaD conjugados fluorescentemente no tubo neural poderia marcar os endossomos de Sara especificamente em células neuroepiteliais, e os endossomos anti-DeltaD contendo Sara segregam preferencialmente em células filhas em proliferação¹⁰. Tem sido sugerido que a sinalização de Notch dos endossomos poderia regular o destino das células filhas. Resultados anteriores mostraram que a maioria das células RGP do peixe-zebra no prosencéfalo em desenvolvimento sofre DCA, e a determinação do destino da célula filha é dependente da sinalização intralinhagem Notch/DeltaD¹¹. A fim de elucidar a natureza da sinalização Notch/DeltaD intralinhagem em RGPs de peixe-zebra, desenvolvemos o ensaio de captação de anticorpos anti-DeltaD no cérebro em desenvolvimento do peixe-zebra. Usando este protocolo, realizamos com sucesso a marcação ao vivo e imagens do tráfego endocítico de DeltaD em RGPs mitóticos.

O anticorpo anti-DeltaD fluorescentemente marcado é eficientemente internalizado nos RGPs ao longo do ventrículo prosencéfalo. Isso facilitou sobremaneira a descoberta do tráfego direcional de endossomos DeltaD nos RGPs de divisão assimétrica^12,13. Em comparação com protocolos anteriores de captação de anticorpos desenvolvidos para culturas de Drosophila notum e medula espinhal de peixe-zebra 10, este protocolo alcançou marcação anti-DeltaD de longa duração e altamente eficiente na camada de células do ventrículo cerebral, especificamente com menos de¹⁰ nL de mistura de anticorpos microinjetados. A injeção do ventrículo do rombencéfalo é muito conveniente para a aplicação do ensaio de captação de anticorpos no cérebro em desenvolvimento, pois o ventrículo do rombencéfalo é bem expandido em embriões de peixe-zebra e preenchido com líquido cefalorraquidiano no estágio inicial de desenvolvimento¹⁴. Ao injetar a mistura de anticorpos no ventrículo do rombencéfalo sem ferir nenhum tecido crucial em desenvolvimento, o protocolo minimizou ao máximo possíveis danos à zona de imagem no prosencéfalo. A dose reduzida do anticorpo primário injetado também evitou potenciais efeitos colaterais de interferir com a sinalização endógena Delta-Notch in vivo. Este protocolo pode ser facilmente combinado com outras perturbações farmacológicas ou genéticas, utilizado em diferentes estágios de desenvolvimento, e possivelmente adaptado ao cérebro adulto, bem como organoides cerebrais 2D/3D derivados de células-tronco pluripotentes humanas. Em conjunto, o protocolo possibilitou entender como e quando a assimetria de sinalização de Notch é estabelecida durante a DCA. O principal desafio para a implementação bem-sucedida deste protocolo é alcançar a entrega precisa de concentrações apropriadas do anticorpo com base em condições experimentais específicas.