Antikörperaufnahme-Assay zur Verfolgung der Notch/Delta-Endozytose während der asymmetrischen Teilung von radialen Zebrafisch-Gliavorläuferzellen

Der Notch-Signalweg steuert die Entscheidung über das Zellschicksal und die Musterbildung während der Entwicklung in Metazoen¹, und neuere Studien haben gezeigt, dass der Notch-Signalweg bei der Stammzellteilung hauptsächlich vom endozytären Transport abhängt ^2,3. Endozytosiertes Notch/Delta kann den Notch-Signalweg im Zellkern aktivieren und die Transkription der Notch-Zielgene ^4,5,6 verbessern. Directional Notch/Delta endosomaler Transport wurde erstmals in Drosophila-Sinnesorgan-Vorläuferzellen (SOP) während der asymmetrischen Zellteilung (ACD) beobachtet, was zu einer höheren Notch-Signalaktivität in pIIa als in pIIb^{führte 7,8}. Antikörperaufnahme-Assays mit Anti-Delta- und Anti-Notch-Antikörpern wurden eingesetzt, um den endozytären Prozess in mitotischen SOP-Zellen zu überwachen. Notch/DeltaD-Endosomen bewegen sich während der Zytokinese zusammen mit einem Kinesin-Motorprotein zur zentralen Spindel und werden aufgrund der antiparallelen Anordnung der asymmetrischen Zentralspindel im letzten Moment der Zellteilung asymmetrisch in die pIIa-Zelle transloziert ^3,8. Diese Studien haben Aufschluss über die molekularen Mechanismen gegeben, die die asymmetrische Teilung in Drosophila-SOP-Zellen regulieren, aber es ist unklar, ob ähnliche endozytäre Prozesse in radialen Gliavorläuferzellen (RGPs) von Wirbeltieren ablaufen.

Darüber hinaus sind die molekularen Mechanismen, die den asymmetrischen Notch/DeltaD-Signalweg während der RGP-Teilung von Wirbeltieren regulieren, nicht gut verstanden. Im Zebrafisch wurde berichtet, dass die Interaktion von Notch und Delta die Endozytose des DeltaD-Liganden⁹ erleichtert. Es ist nicht bekannt, ob die DeltaD-Endozytose die Wahl des Zellschicksals von Tochterzellen im sich entwickelnden Wirbeltiergehirn beeinflussen kann. Neuere Studien zeigen, dass die Injektion fluoreszenzkonjugierter Anti-DeltaD-Antikörper in das Neuralrohr Sara-Endosomen spezifisch in Neuroepithelzellen markieren könnte, und Anti-DeltaD-haltige Sara-Endosomen segregieren bevorzugt in proliferierende Tochterzellen¹⁰. Es wurde vermutet, dass der Notch-Signalweg von den Endosomen das Schicksal der Tochterzellen regulieren könnte. Frühere Ergebnisse haben gezeigt, dass die meisten RGP-Zellen des Zebrafisches im sich entwickelnden Vorderhirn einer ACD unterziehen, und die Bestimmung des Schicksals der Tochterzellen hängt von der intralinearen Notch/DeltaD-Signaltransduktion^{ab 11}. Um die Natur des Intralineage-Notch/DeltaD-Signalwegs in Zebrafisch-RGPs aufzuklären, haben wir den Anti-DeltaD-Antikörper-Aufnahme-Assay im sich entwickelnden Gehirn von Zebrafischen entwickelt. Mit diesem Protokoll haben wir erfolgreich Live-Markierungen und Bildgebungen des endozytären DeltaD-Transports in mitotischen RGPs durchgeführt.

Der fluoreszenzmarkierte Anti-DeltaD-Antikörper wird entlang des Vorderhirnventrikels effizient in die RGPs internalisiert. Es hat die Entdeckung des gerichteten Transports von DeltaD-Endosomen in den asymmetrisch teilenden RGPs erheblich erleichtert^12,13. Im Vergleich zu früheren Antikörperaufnahmeprotokollen, die für Drosophila notum-Kulturen und das Rückenmark des Zebrafisches entwickelt wurden 10, hat dieses Protokoll eine lang anhaltende und hocheffiziente Anti-DeltaD-Markierung in der Zellschicht des Hirnventrikels erreicht, insbesondere mit weniger als¹⁰ nL mikroinjizierter Antikörpermischung. Die Injektion des Hinterhirnventrikels ist sehr praktisch für die Anwendung des Antikörperaufnahmetests im sich entwickelnden Gehirn, da der Hinterhirnventrikel in Zebrafischembryonen gut erweitert und im frühen Entwicklungsstadium mit Liquor cerebrospinalis gefüllt ist¹⁴. Durch die Injektion des Antikörpergemisches in die Hinterhirnkammer, ohne wichtige sich entwickelnde Gewebe zu verletzen, hat das Protokoll eine mögliche Schädigung der Bildgebungszone im Vorderhirn so weit wie möglich minimiert. Die reduzierte Dosis des injizierten Primärantikörpers hat auch mögliche Nebenwirkungen einer Störung des endogenen Delta-Notch-Signalwegs in vivo vermieden. Dieses Protokoll kann leicht mit anderen pharmakologischen oder genetischen Störungen kombiniert, in verschiedenen Entwicklungsstadien eingesetzt und möglicherweise an das erwachsene Gehirn sowie an aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gewonnene 2D/3D-Gehirnorganoide angepasst werden. Zusammenfassend hat das Protokoll es möglich gemacht zu verstehen, wie und wann eine Notch-Signalasymmetrie während der ACD entsteht. Die größte Herausforderung für die erfolgreiche Implementierung dieses Protokolls besteht darin, eine präzise Abgabe geeigneter Konzentrationen des Antikörpers auf der Grundlage spezifischer experimenteller Bedingungen zu erreichen.