הערכת רעילות כימית במלנוגסטר דרוזופילה למבוגרים

הערה: יש ללבוש כפפות ניטריל עבור כל השלבים בפרוטוקול זה. יש ללבוש חלוק מעבדה, מגן עיניים ו/או מכונות הנשמה, בהתאם לגיליונות נתוני הבטיחות עבור כל כימיקל מוערך. 1. הכנת בקבוקון ותא לחות הערה: ניתן להשלים את שלבים 1.1-1.5 בכל עת לפני תחילת קטעי הניסוי האחרים. יש ללבוש כפפות ניטריל בכל עת במהלך הכנת הבקבוקון כדי למנוע זיהום. ערמו ארבעה גיליונות של נייר כרומטוגרפיה תאית דרגה 1 (ראו טבלת חומרים) וחתכו אותם ל-2 ברצועות רחבות. נקב את תוספות נייר הפילטר בצורת פרח באמצעות ניקוב נייר בגודל 1.5 אינץ’ המכיל מת בצורת פרח. השתמש בדיבל עץ ללא לכה בגודל 22 מ”מ x 220 מ”מ כדי לדחוף את נייר הסינון לתחתית בקבוקון פוליפרופילן בקוטר 28.5 מ”מ. ודא שערימת נייר הסינון ממוקמת היטב בתחתית הבקבוקון. אחסנו את הבקבוקונים המוכנים במגשי פלסטיק או קרטון והניחו את המגשים בשקיות ניילון גדולות (~ 280 מ”מ x 240 מ”מ) עד לשימוש. בנה תא לחות על ידי חיתוך חור בגודל 120 מ”מ x 280 מ”מ במכסה הפלסטיק של גיגית פלסטיק בגודל 606.24 מ”מ x 225.42 מ”מ x 403.22 מ”מ (ראה טבלת חומרים). הדביקו את הרשת מעל החור כדי לאפשר זרימת אוויר. חתכו קטע מרשת הפלסטיק מלוחות תאורת תקרה עם תריסים (במקור 610 מ”מ x 1220 מ”מ) כדי להתאים לתחתית אמבט הפלסטיק המשמש בשלב 1.4.הערה: ניתן להשתמש במגוון אמבטיות פלסטיק שונות וחומרי רשת פלסטיק/מתכת לבניית תא לחות. 2. גידול זבובים התחל תרביות של זבובים בוגרים (מינימום 30 מבוגרים) בבקבוקי חלב מזכוכית המכילים מדיה סטנדרטית של Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)31. סגרו את הבקבוקים עם תקע קרניים עטוף במגבון משימה עדין. אל תצטופפו בבקבוקים.הערה: מספר הבקבוקים הנדרשים תלוי במספר החשיפות הכימיות המתבצעות ובגנוטיפ של זן הבדיקה. בדרך כלל, כמה מאות זבובים ניתן להשיג מבקבוק יחיד בעת שימוש במלאי חזק ו fecund. הבדיקה הסטנדרטית משתמשת בזבובי בר מסוג Oregon-R (מלאי BDSC #2057), אך ניתן להשתמש בכל גנוטיפ(ים) מעניינים עם פרוטוקול זה. זכור כי גנוטיפים פגומים עם צואה נמוכה ו / או כדאיות דורשים תרביות בקבוק מוגברת. דגרו על מגשי בקבוקי התרבית בטמפרטורה של 25°C עם לחות של כ-60% ומחזור אור:כהה של 12:12 שעות עד לצפייה בכוכב הזחל השלישי או בשלבי הגלמים המוקדמים. שלב זה ניתן לזיהוי על ידי נוכחות הזחלים המשוטטים בצידי הבקבוק והופעת הגלמים על דפנות הבקבוק.הערה: טפל בזבובים רק במהלך תקופת הדלקת האורות של מחזור האור:חושך של 12:12 שעות. עבור מלאי חזק, בקבוקים מגיעים לשלב זה לאחר 3-4 ימים בתנאים המתוארים.הסר זבובים בוגרים וקבע את נזילות התקשורת. אם המדיה זורמת לאורך דופן הבקבוק כשהיא הפוכה, המדיום נוזלי מדי. הכניסו מגבון משימה עדין או כדור קרניים לתחתית הבקבוק כדי למצק את מזון הזבובים. כאשר הזבובים מתחילים להיסגר, נקו את כל הבוגרים מהבקבוקים ואפשרו לגלמים להמשיך להיסגר במשך 48 שעות. בשלב זה, כל מבוגר ששוחרר מבקבוקי התרבית יכול להיות מועבר לבקבוקים חדשים כדי להפיץ את המלאי (ראה שלב 2.1) או לזרוק. העברת זבובים שנסגרים בתקופה של 48 שעות לבקבוקים חדשים המכילים מדיה BDSC סטנדרטית. גיל 3 ימים.הערה: המבוגרים בבקבוקים אלה הם בני 3-5 ימים וניתן להשתמש בהם בניסויי קטלניות והאכלה. הבקבוקים המשמשים ליישון זבובים בוגרים יכילו ביצים וזחלים. כתוצאה מכך, בקבוקים אלה יכולים לשמש להפצת הדור הבא של הזבובים. 3. הכנת זבובים לחשיפה כימית הרדימו זבובים בני 5-7 ימים עם CO2. מיין את הזבובים המורדמים לפי מין באמצעות איברי המין שלהם. לסיוע בהרדמה ובמין זבובים, ראו הערה28. הכניסו קבוצות של 20 זבובים זכרים או 20 נקבות לבקבוקונים המכילים מדיה סטנדרטית של BDSC. סגור את הבקבוקון עם תקע קרניים ואחסן את בקבוקוני הזכר והנקבה בנפרד. סמנו את הבקבוקונים המכילים נקבות זבובים בפס. השאירו את הבקבוקונים עם זבובים זכרים לא מסומנים כדי למנוע ערבוב מינים בטעות.הערה: מספר הבקבוקונים שיש להכין בשלב 3.2 מוכתב על ידי גודל ניסויי החשיפה. כפי שמתואר בשלבים 5.3 ו-5.6, ניסוי טיפוסי למציאת טווח עבור כימיקל בדיקה יחיד דורש מינימום של 40 בקבוקונים של זכרים ו-40 בקבוקונים של נקבות. ניסוי סטנדרטי של עקומת מנה-תגובה, המתואר בשלבים 7.4 ו-7.8, דורש מינימום של 63 בקבוקונים של זכרים ו-63 בקבוקונים של נקבות. אחסנו את הבקבוקונים למשך 48 שעות באינקובטור בטמפרטורה של 25°C בלחות של כ-60% ועם מחזור אור:כהה של 12:12 שעות. במהלך תקופה זו, הניחו את מגש הבקבוקונים הממוינים בזווית של 60 מעלות כדי למנוע מזבובים להיתקע במזון בזמן שהם מתאוששים מההרדמה.הערה: שלב זה מאפשר לזבובים להתאושש מהרדמתCO2 . אין להרדים שוב את הזבובים במהלך שארית פרוטוקול החשיפה. לאחר תקופת ההחלמה של 48 שעות, הוסף 0.75 מ”ל מים מטוהרים סטריליים לבקבוקונים שהוכנו בשלב 1.3. מספר הבקבוקונים שהוכנו בשלב זה צריך להיות זהה למספר הבקבוקונים שהוגדרו בשלב 3.2. מעבירים זבובים ממוינים ומותאמים מין לבקבוקון הרעב על ידי פתיחת בקבוקון הזכוכית המכיל את הזבובים משלב 3.2, הכנסתו לפיו של בקבוקון הפלסטיק המוכן, ולאחר מכן הקשה על תחתית בקבוקון הפלסטיק על ספסל. סגור את בקבוקון הפלסטיק עם תקע תאית אצטט (הידוע בכינויו פלוג).רשום את כל הזבובים שאבדו בהעברה זו (העבר לרשומות של מספר הזבובים ההתחלתי עבור כל בקבוקון מאוחר יותר). סמן בקבוקוני רעב המכילים נקבות זבובים עם פס. השאירו את הבקבוקונים עם זבובים זכרים לא מסומנים כדי למנוע ערבוב מינים בטעות. הכינו את תא הלחות לחשיפה למשך הלילה. ראה שלבים 1.4-1.5 לקבלת תיאור כיצד לבנות תא זה.הניחו שש מגבות נייר סטנדרטיות בתחתית תא הלחות. משרים את מגבות הנייר ב-100 מ”ל מים. הניחו את רשת הפלסטיק (שלב 1.5) מעל המגבות הרטובות כדי להבטיח שהבקבוקונים לא יבואו במגע עם מגבות הנייר הרוויות. הניחו את מגשי בקבוקוני הרעב במצב אופקי בתוך תאי הלחות. הניחו את תאי הלחות באינקובטור של 25°C (בלחות של כ-60%) למשך הלילה.הערה: באופן אידיאלי, תקופת הרעב בלילה נמשכת כ -16 שעות; עם זאת, ניתן להתאים את העיתוי ללוחות זמנים בודדים במעבדה. 4. הכנת פתרונות מלאי הערה: זבובים מוזנים בכימיקלים ניסיוניים במצע נוזלי של שמרים-סוכרוז. סעיף זה מתאר הכנת תמיסות מלאי של אמצעי הזנה מרוכזים וכימיקלים לבדיקה. הכינו תמיסת 4x שמרים-סוכרוז המכילה 16% סוכרוז ו-6% תמצית שמרים (m/v) (ראו טבלת חומרים) מומסת במים מטוהרים סטריליים. Autoclave את התמיסה על מחזור נוזלי עבור זמן העיקור המתאים (למשל, 40 דקות עבור 1 L).הערה: הפתרון יכול להיעשות בכמויות גדולות ומאוחסן aliquots ב -20 °C. הפשירו אליציטוטים בודדים יום אחד לפני השימוש על ידי הכנסתם למקרר בטמפרטורה של 4°C. הכינו מלאי של כימיקל הבדיקה. עבור הניסוי הראשוני, פתרון המניות צריך להיעשות בריכוז הגבוה ביותר, כך הכימיקל יכול להיות מומס לחלוטין במים.הערה: ניתן להשתמש בממסים שאינם מים כדי להמיס את כימיקל הבדיקה. ראה דיון לגבי אזהרות לשימוש בממסים חלופיים. הכינו תמיסת מלאי צבע כחול 100x על ידי המסת 1 גרם של FD&C כחול מס’ 1 (ראו טבלת חומרים) ב-10 מ”ל מים מטוהרים סטריליים.הערה: ניתן לייצר את תמיסת מלאי הצבע הכחול בכמויות גדולות ולאחסן ב- aliquots ב- 4 °C. 5. הכנת בקבוקוני חשיפה: ניסוי מציאת טווח הערה: שלבים 5 ו-6 של הפרוטוקול נועדו לזהות את המינון הנמוך ביותר של כימיקל בדיקה שגורם ל-100% קטלניות ואת המינון הגבוה ביותר שלא מצליח לגרום לפנוטיפ קטלני. אם ריכוזים אלה כבר נקבעו על ידי ניסויים קודמים, ראה שלבים 7 ו- 8 לחישוב עקומת מנה-תגובה. יש להכין את אמצעי החשיפה מיד לפני הוספת זבובים לבקבוקוני החשיפה. סמן שמונה צינורות צנטריפוגות בנפח 15 מ”ל באופן הבא: (i) ללא כימיקל, (ii) הריכוז הגבוה ביותר, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 ו-1:1,000. הכן את מדיית החשיפה בצינורות הצנטריפוגות המסומנים משלב 5.1 על-ידי הוספה ראשונה של 2.5 מ”ל של תמיסת מלאי שמרים/סוכרוז 4x לכל שמונת הצינורות המסומנים.הוסף 7.5 מ”ל של מים מטוהרים סטריליים לצינור שכותרתו “ללא כימיקלים”. דילול זה הוא השליטה השלילית. הוסף 7.4 מ”ל של תמיסת המלאי הכימי לבדיקה לצינור המסומן כ”ריכוז הגבוה ביותר”. הוסף 100 μL של מים מטוהרים סטריליים לצינור זה, כך נפח הסופי הוא 10 מ”ל. חשב ורשום את הטוחנת של כימיקל הבדיקה בתמיסה זו.הערה: תוספת של 100 μL של מים מטוהרים סטריליים לצינור מבטיחה שהריכוז הכימי בשלב זה יהיה זהה לזה המשמש בשלב 5.5, שבו מוסיפים תמיסת מלאי צבע כחול למדיית החשיפה כשיטה להערכת התנהגות האכלה. הוסף את הכמות המתאימה של תמיסת מלאי כימי בדיקה ומים מטוהרים סטריליים לצינורות הנותרים. הנפח הסופי של כל צינור חייב להיות 10 מ”ל. הריכוז הסופי של כימיקלים לבדיקה בצינורות אלה ביחס לצינור “הריכוז הגבוה ביותר” חייב להיות 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 ו-1:1,000. הכינו ותייגו שמונה בקבוקוני חשיפה עבור כל ריכוז בודד של מדיית חשיפה הנוצרת בשלב 5.1. צריכים להיות שמונה סטים של בקבוקונים (64 בקבוקונים בסך הכל) המכילים את התוויות הבאות: ללא כימיקלים, הריכוז הגבוה ביותר, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 ו-1:1,000.פיפטה 0.75 מ”ל של מדיה חשיפה מוכן בשלב 5.2.3 לתוך הקבוצה המתאימה של בקבוקוני חשיפה. סמן שמונה צינורות נפרדים של 5 מ”ל באופן הבא: (i) ללא כימיקל, (ii) הריכוז הגבוה ביותר, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 ו-1:1,000. הכינו מדיה לחשיפה לצבע כחול על ידי ערבוב ראשוני של 500 מיקרוליטר של תמיסת מלאי שמרים/סוכרוז 4x ו-20 מיקרוליטר של תמיסת מלאי צבע כחול בשמונה צינורות מסומנים של 5 מ”ל.הוסף 1.48 מ”ל של מים מטוהרים סטריליים לצינור שכותרתו “ללא כימיקל”. דילול זה הוא השליטה השלילית. הוסף 1.48 מ”ל של תמיסת המלאי הכימי לבדיקה לצינור המסומן כ”ריכוז הגבוה ביותר”. לא מוסיפים מים לצינור זה. חשב ורשום את הטוחנת של כימיקל הבדיקה בתמיסה זו. הוסף את הכמות המתאימה של תמיסת מלאי כימי בדיקה ומים מטוהרים סטריליים לצינורות הנותרים. הנפח הסופי של כל צינור צריך להיות 2 מ”ל. הריכוז הסופי של כימיקל הבדיקה בצינורות אלה ביחס לצינור “הריכוז הגבוה ביותר” צריך להיות 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 ו-1:1,000. הכינו ותייגו שני בקבוקוני חשיפה עם כל ריכוז בנפרד של מדיית חשיפה כחולה. צריכים להיות שמונה סטים של בקבוקונים (16 בקבוקונים בסך הכל) המכילים את התוויות הבאות: ללא כימיקלים, הריכוז הגבוה ביותר, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 ו-1:1,000. המילה “כחול” צריכה להיות כתובה גם על בקבוקונים אלה.פיפטה 0.75 מ”ל של מדיה חשיפה כחולה לתוך הקבוצה המתאימה של בקבוקוני חשיפה כחולים. 6. חשיפה כימית לזבובים: ניסוי מציאת טווח הכינו בקבוקוני חשיפה כימית באמצעות בקבוקונים של זבובים מורעבים למשך לילה משלב 3.7 באופן הבא:מעבירים ארבעה בקבוקונים של נקבות זבובים מורעבות (20 זבובים לבקבוקון) לארבעה בקבוקוני חשיפה מכל ריכוז כימי. תייגו בקבוקונים אלה כ”נקבה”. השתמש באותה שיטת העברה המתוארת בשלב 3.5. מעבירים ארבעה בקבוקונים של זבובים זכרים מורעבים (20 זבובים לבקבוקון) לארבעה בקבוקוני חשיפה מכל ריכוז כימי. תייגו בקבוקונים אלה כ”זכר”. השתמש באותה שיטת העברה המתוארת בשלב 3.5. הכינו בקבוקוני חשיפה כימית המכילים צבע כחול באמצעות בקבוקונים של זבובים מורעבים מהלילה משלב 3.7 כדלקמן:מעבירים בקבוקון אחד של נקבות זבובים מורעבות (20 זבובים לבקבוקון) לבקבוקון חשיפה כחול אחד לכל ריכוז כימי. תייגו בקבוקון זה כ”נקבה”. השתמש באותה שיטת העברה המתוארת בשלב 3.5. מעבירים בקבוקון אחד של זבובים זכרים מורעבים (20 זבובים לבקבוקון) לבקבוקון חשיפה כחול אחד לכל ריכוז כימי. תייגו את הבקבוקון הזה כ”זכר”. השתמש באותה שיטת העברה המתוארת בשלב 3.5. רשום את מספר הזבובים שנמצאים בכל בקבוקון לאחר ההעברה וציין את מספר הזבובים שמתו או ברחו. בדרך כלל, כל 20 הזבובים צריכים לשרוד רעב לילה והעברה. הניחו את בקבוקוני החשיפה אופקית בתאי לחות טריים שהוכנו (ראו שלב 3.6 להכנת תא לחות). מקם את התאים באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס עם כ -60% לחות ומחזור אור: כהה של 12:12 שעות. יש לבחון את בקבוקוני החשיפה 24 ו-48 שעות לאחר תחילת החשיפה לכימיקלים. ספור ורשום את מספר הזבובים המתים בכל בקבוקון בכל נקודת זמן.הערה: מוות משמש כקריאה לבדיקה זו, אך ניתן להתאים את הפרוטוקול לבחינת פנוטיפים אחרים. זבובים חשופים נאספים בדרך כלל בנקודות זמן אלה לצורך מחקרים תעתיק ומטבולי. בדקו את בקבוקוני החשיפה הכחולים 24 שעות לאחר תחילת החשיפה הכימית. השתמש בטכניקות הבאות כדי לקבוע אם זבובים חשופים צרכו את מדיית החשיפה הכחולה:בדוק את דפנות הבקבוקון עבור אינדיקציות של צואה כחולה, אשר מופיעים כמו נקודות קטנות בצד של בקבוקון החשיפה, כמו גם על flug. מרדימים את הזבובים עם CO2 ובודקים את הבטן לנוכחות צבע כחול.הערה: בדרך כלל, בקבוקוני חשיפה כחולים מנותחים לאחר 24 שעות. עם זאת, שלב זה יכול להתבצע ב 48 שעות, במקום. לזבובים שאכלו בדרך כלל יש פס כחול דרך הבטן, מה שמעיד על כך שאמצעי החשיפה נכנסו למעיים. בחנו את הזבובים להתנהגויות אכילה חריגות, כגון רגורגיטציה, התנפחות יבולים והתמוטטות של תפקוד מחסום המעי (מסומן על ידי הופעת צבע כחול ברחבי האורגניזם ולא רק מוגבל למערכת העיכול, המכונה בדרך כלל דרדסים32,33). יש להשליך את כל הבקבוקונים, נייר הסינון, הפלוגים והזבובים המזוהמים במיכלי פסולת כימית מתאימים. אם זבובים חיים נשארים בבקבוקונים, הקפיאו את הבקבוקונים כדי להרוג את הזבובים לפני השלכתם למיכל הפסולת המתאים.הערה: סילוק בקבוקוני חשיפה וזבובים מוכתב על ידי הכימיקלים המנותחים בניסוי. פעל תמיד בהתאם לנוהלי הבטיחות הכימיים המפורטים בדף נתוני הבטיחות הכימית. אם הריכוזים המשמשים בניסוי מציאת הטווח הורגים זבובים במינון הנמוך ביותר, חזרו על סעיף 6 באמצעות סדרת דילול, החל מהריכוז הנמוך ביותר שהרג 100% מהחיות. 7. הכנת בקבוקוני חשיפה: יצירת עקומת מנה-תגובה הערה: הפרוטוקול המתואר בשלבים 5 ו-6 נועד לקבוע באופן נרחב את הריכוז הכימי הדרוש ליצירת פנוטיפ. שלבים 7 ו-8 של הפרוטוקול משמשים לחישוב עקומת מנה-תגובה מדויקת. חשב את הריכוזים הכימיים שיש לנתח כדי ליצור עקומת מנה-תגובה בשיטה הבאה:קבע את הריכוז הנמוך ביותר של כימיקל הבדיקה שהורג 100% מהזבובים החשופים לאחר 48 שעות. לקבוע את הריכוז הגבוה ביותר של כימיקל הבדיקה שאין לו השפעה על הכדאיות ב 48 שעות. חישוב ארבעה ריכוזים נוספים המתחלקים שווה בשווה בין הריכוזים שנקבעו בשלבים 7.1.1 ו-7.1.2. סמן תשעה צינורות צנטריפוגות בודדות של 15 מ”ל עם הטוחנת של הריכוזים הבאים: (i) ללא כימיקל, (ii) ריכוז שנקבע בשלב 7.1.1, (iii) ריכוז שנקבע בשלב 7.1.2, (iv) ריכוזים שנקבעו ב-7.1.3, (v) כפול מהריכוז שנקבע בשלב 7.1.1, (vi) דילול ריכוז של 1:2 שנקבע בשלב 7.1.2.הערה: הכללת ריכוזים כפולים מהריכוז שנקבע ב-7.1.1 ודילול של 1:2 מזה שנקבע בשלב 7.1.2 חשובה לחישוב מדויק של עקומת המינון-תגובה. הכן את מדיית החשיפה על ידי הוספה ראשונה של 2.5 מ”ל של תמיסת מלאי שמרים/סוכרוז 4x לתשעה צינורות צנטריפוגות בודדות מסומנות של 15 מ”ל שהוכנו בשלב 7.2.הוסף 7.5 מ”ל של מים מטוהרים סטריליים לצינור שכותרתו “ללא כימיקלים”. דילול זה הוא השליטה השלילית. הוסף את הכמות המתאימה של תמיסת מלאי כימי בדיקה ומים מטוהרים סטריליים לצינורות הנותרים. הנפח הסופי של כל צינור חייב להיות 10 מ”ל. הריכוז הסופי של כימיקל בתוך צינור בודד צריך להיות שווה לזה שנכתב בצד החיצוני של הצינור. הכינו ותייגו 12 בקבוקוני חשיפה עבור כל ריכוז של מדיית חשיפה הנוצרת בשלב 7.2. צריך להיות תשעה סטים של בקבוקונים (108 בקבוקונים בסך הכל). פיפטה 0.75 מ”ל של מדיה חשיפה לתוך קבוצה המתאימה של בקבוקוני חשיפה.הערה: שלבים 7.6 עד 7.8 הם אופציונליים. אם ידוע שהריכוזים הכימיים שהוכנו בשלב 7.2 אינם משפיעים על התנהגות ההאכלה, ניתן לדלג על שלבים אלה. הכינו ותייגו תשעה צינורות שונים של 5 מ”ל עבור מדיה בחשיפה כחולה עם אותה סדרת ריכוזים המשמשת בשלב 7.2. הכינו מדיה לחשיפה לצבע כחול על ידי ערבוב ראשוני של 500 μL של תמיסת מלאי שמרים/סוכרוז 4x ו-20 μL של תמיסת ציר צבע כחול.הוסף 1.48 מ”ל של מים סטריליים מטוהרים לצינור שכותרתו “ללא כימיקלים”. דילול זה הוא השליטה השלילית. הוסף את הכמות המתאימה של תמיסת מלאי כימי בדיקה ומים סטריליים מטוהרים לצינורות הנותרים. הנפח הסופי של כל צינור חייב להיות 2 מ”ל. הריכוז הסופי של כימיקל בתוך צינור בודד צריך להיות שווה לזה שנכתב בצד החיצוני של הצינור. הכינו ותייגו שני בקבוקוני חשיפה לכל ריכוז בודד של מדיית חשיפה כחולה. צריכות להיות תשע קבוצות של בקבוקונים (18 בקבוקונים בסך הכל), כאשר כל קבוצה של בקבוקונים מסומנת בריכוזים המפורטים בשלב 7.2. המילה “כחול” צריכה להיות כתובה גם על בקבוקונים אלה.פיפטה 0.75 מ”ל של מדיה חשיפה כחולה לתוך הקבוצה המתאימה של בקבוקוני חשיפה כחולים. 8. חשיפה לכימיקלים של זבובים: יצירת עקומת מנה-תגובה הכינו בקבוקוני חשיפה כימית באמצעות בקבוקונים של זבובים מורעבים למשך לילה משלב 3.7 באופן הבא:מעבירים שישה בקבוקונים של נקבות זבובים מורעבות (20 זבובים לבקבוקון) לשישה בקבוקוני חשיפה מכל ריכוז כימי. תייגו בקבוקונים אלה כ”נקבה”. השתמש באותה שיטת העברה המתוארת בשלב 3.5. מעבירים שישה בקבוקונים של זבובים זכרים מורעבים (20 זבובים לבקבוקון) לשישה בקבוקוני חשיפה מכל ריכוז כימי. תייגו בקבוקונים אלה כ”זכר”. השתמש באותה שיטת העברה המתוארת בשלב 3.5. הכינו בקבוקוני חשיפה כימית המכילים צבע כחול באמצעות בקבוקונים של זבובים מורעבים מהלילה משלב 3.7 כדלקמן:מעבירים בקבוקון אחד של נקבות זבובים מורעבות (20 זבובים לבקבוקון) לבקבוקון חשיפה כחול אחד לכל ריכוז כימי. תייגו בקבוקון זה כ”נקבה”. השתמש באותה שיטת העברה המתוארת בשלב 3.5. מעבירים בקבוקון אחד של זבובים זכרים מורעבים (עשרים זבובים בכל בקבוקון) לבקבוקון חשיפה כחול אחד לכל ריכוז כימי. תייגו את הבקבוקון הזה כ”זכר”. השתמש באותה שיטת העברה המתוארת בשלב 3.5. רשום את מספר הזבובים הנמצאים בכל בקבוקון לאחר ההעברה. בדרך כלל, כל 20 הזבובים צריכים לשרוד את הרעב וההעברה בלילה, אך יש לוודא שכל מה שמת או נמלט במהלך ההעברה יופחת מהסך הכולל. הניחו את בקבוקוני החשיפה אופקית בתאי לחות טריים שהוכנו (ראו שלב 3.6 להכנת תא לחות). מקם את התאים באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס עם כ -60% לחות ומחזור אור: כהה של 12:12 שעות. יש לבחון את בקבוקוני החשיפה 24 ו-48 שעות לאחר תחילת החשיפה לכימיקלים. ספור ורשום את מספר הזבובים המתים בכל בקבוקון בכל נקודת זמן. בדקו את בקבוקוני החשיפה הכחולים 24 שעות לאחר תחילת החשיפה הכימית. השתמש בשיטה המתוארת בשלב 6.6 כדי להעריך שינויים בהתנהגות ההאכלה. יש להשליך את כל הבקבוקונים, נייר הסינון, הפלוגים והזבובים המזוהמים במיכלי פסולת כימית מתאימים. אם נשארים זבובים חיים בבקבוקונים, הקפיאו את הבקבוקונים כדי להרוג את הזבובים לפני השלכתם למיכל הפסולת המתאים.הערה: סילוק בקבוקוני חשיפה וזבובים מוכתב על ידי הכימיקלים המנותחים בניסוי. פעל תמיד בהתאם לנוהלי הבטיחות הכימיים המפורטים בדף נתוני הבטיחות הכימית. 9. חישוב עקומת מנה-תגובה השתמש בתוכנת Benchmark Dose (BMDS, גרסה 3.2; ראה טבלת חומרים) או בתוכנה דומה אחרת כדי לנתח את הנתונים34. להלן תיאור זרימת העבודה באמצעות תוכנת BMDS. לחץ על הכרטיסייה נתונים של BMDS ולחץ על הכנס ערכת נתונים חדשה. הזן את מספר הדגימות בערכת הנתונים, לחץ על דיכוטומי ולאחר מכן לחץ על צור ערכת נתונים. הזן כל שכפול כשורה נפרדת בערכת הנתונים. הזן את המינון בעמודה הראשונה של הטבלה שנוצרה, את המספר ההתחלתי של זבובים למעט זבובים שמתו או אבדו לפני שלב 8.3) בעמודה השנייה, ואת מספר הזבובים שמתו מחשיפה כימית בעמודה השלישית. לחץ על הכרטיסייה הראשית של BMDS. לחץ על החץ הנפתח עבור התפריט בחר סוג דגם ולחץ על דיכוטומי. לחץ על הפוך לזמין עבור ערכת הנתונים משלב 9.2 בטבלה ערכות נתונים. לחץ על התיבות עבור המודלים הרצויים לניתוח בטבלת MLE וחלופות.הערה: מודל הגבעה הדיכוטומית המוגבלת התכופה שימש בעיקר. לחץ על ניתוח הפעלה. התוכנה תפיק קובץ פלט עם עקומות הקטלניות ופרטים נוספים על המודלים.