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Biology

Evaluación de la toxicidad química en adultos Drosophila melanogaster

Published: March 24, 2023
doi:
10.3791/65029
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1Department of Biology,Indiana University, 2Bloomington Drosophila Stock Center, Department of Biology,Indiana University, 3School of Biosciences,University of Birmingham, 4O’Neill School of Public and Environmental Affairs,Indiana University, 5Section of Developmental Genomics, Laboratory of Biochemistry and Genetics, National Institute of Diabetes and Kidney and Digestive Diseases,National Institutes of Health

Summary

Este protocolo describe un método eficiente y económico que utiliza medios líquidos para evaluar los efectos de los tóxicos químicos sobre la viabilidad de Drosophila melanogaster adulta.

Abstract

Las industrias humanas generan cientos de miles de productos químicos, muchos de los cuales no han sido estudiados adecuadamente para la seguridad ambiental o los efectos en la salud humana. Este déficit de información sobre seguridad química se ve exacerbado por los métodos de prueba actuales en mamíferos que son costosos, requieren mucha mano de obra y mucho tiempo. Recientemente, los científicos y los reguladores han estado trabajando para desarrollar nuevas metodologías de enfoque (NAMs) para pruebas de seguridad química que sean más baratas, más rápidas y reduzcan el sufrimiento de los animales. Uno de los NAM clave que emergen es el uso de organismos invertebrados como sustitutos de modelos de mamíferos para dilucidar los modos de acción químicos conservados en especies lejanamente relacionadas, incluidos los humanos. Para avanzar en estos esfuerzos, aquí, describimos un método que utiliza la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, para evaluar la seguridad química. El protocolo describe un procedimiento simple, rápido y económico para medir la viabilidad y el comportamiento de alimentación de las moscas adultas expuestas. Además, el protocolo se puede adaptar fácilmente para generar muestras para enfoques genómicos y metabolómicos. En general, el protocolo representa un importante paso adelante en el establecimiento de Drosophila como un modelo estándar para su uso en toxicología de precisión.

Introduction

Los seres humanos están constantemente expuestos a sustancias químicas de una variedad de fuentes, incluyendo aire1, alimentos2, agua3,4, medicamentos5, agentes de limpieza6, productos de cuidado personal 7, productos químicos industriales 7 y materiales de construcción 7. Además, cada año se introducen miles de nuevos productos químicos8, muchos de los cuales no se examinan adecuadamente para la salud y la seguridad ambiental. Esta falta de pruebas adecuadas de seguridad química se debe en parte a una dependencia excesiva de los modelos de mamíferos, como ratones y ratas. Si bien estos modelos de roedores son informativos, las pruebas de seguridad química en estos sistemas son costosas, requieren mucho tiempo y, a menudo, causan niveles inaceptables de sufrimiento al animal de prueba9.

Las cargas financieras y éticas asociadas con las pruebas de seguridad química en mamíferos, así como la naturaleza lenta de los estudios en mamíferos, son factores importantes que contribuyen a la escasez de datos sobre nuevos productos químicos. Para abordar este problema, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA), la Agencia Europea de Sustancias Químicas (ECHA), Health Canada y otras agencias están implementando medidas que incorporan nuevas metodologías de enfoque (NAM) en los marcos regulatorios10, colocando así la política norteamericana y europea en línea con los objetivos internacionales para reemplazar, reducir y refinar el uso de animales (el principio de las 3R)11, 12,13,14. Los MNA abarcan una variedad de ensayos basados principalmente en modelos in vitro e in silico que proporcionan una comprensión mecanicista de la toxicidad química en lugar de observar la adversidad infligida a las especies de ensayo de mamíferos, aumentando así la tasa de generación de datos para la evaluación del riesgo químico y al mismo tiempo produciendo resultados de alta fidelidad15. Sin embargo, aún no se ha demostrado que estos métodos protejan contra la toxicidad sistémica, incluida la interrupción de procesos biológicos vitales que involucran la comunicación interorgánica y la señalización endocrina. Además, no pueden explicar la bioacumulación de sustancias químicas dentro de tejidos específicos, la capacidad de los compuestos individuales para ser absorbidos y secretados, y la interacción entre el comportamiento y la exposición química.

Debido a las limitaciones de los modelos in vitro y computacionales, el uso exitoso de NAMs para reducir o reemplazar los modelos de mamíferos también debe incluir modelos in vivo de invertebrados, como la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster. Estudios previos en la mosca han demostrado que este organismo es muy adecuado para estudiar las vías genéticas conservadas que protegen las células animales contra moléculas tóxicas 16,17,18,19,20,21,22. Además, la mosca muestra una notable similitud genética con los humanos, incluyendo homólogos funcionales a más del 65% de las enfermedades humanas 23,24,25 y una conservación aún mayor de importantes vías funcionales 26. Estas características, combinadas con su ciclo de vida relativamente corto, bajo costo de mantenimiento y respuestas conductuales fácilmente observables, hacen que Drosophila sea adecuado para su uso como modelo toxicológico27,28,29,30. Además, las moscas tienen un rendimiento mucho mayor que los modelos de roedores y capturan efectos sobre el metabolismo, la fisiología y la señalización hormonal que no son fácilmente detectables por otros MNA no organismos9.

El protocolo descrito aquí representa un marco para probar los efectos de la exposición química en Drosophila adulta. El método está diseñado para ser eficiente, económico y reproducible, al tiempo que minimiza el tiempo que los investigadores deben estar en contacto con el químico de prueba y acomoda la recolección de muestras para la metabolómica y otros enfoques ómicos. El protocolo está optimizado para probar un solo producto químico por experimento, pero puede acomodar fácilmente otros parámetros experimentales, como solventes variados o combinaciones de productos químicos.

Protocol

NOTA: Use guantes de nitrilo para todos los pasos de este protocolo. Use una bata de laboratorio, protección para los ojos y / o respiradores, según las hojas de datos de seguridad para cada producto químico evaluado. 1. Preparación del vial y de la cámara de humedad NOTA: Los pasos 1.1-1.5 se pueden completar en cualquier momento antes de comenzar las otras secciones experimentales. Se deben usar guantes de nitrilo en todo momento durante la preparación del vial para evitar la contaminación. Apile cuatro hojas de papel de cromatografía de celulosa de grado 1 (consulte la Tabla de materiales) y córtelas en 2 en tiras anchas. Perfore los insertos de papel de filtro en forma de flor con un punzón de papel de 1,5 pulgadas que contenga un troquel en forma de flor. Utilice una clavija de madera sin barnizar de 22 mm x 220 mm para empujar el papel de filtro hasta el fondo de un vial de polipropileno de 28,5 mm de diámetro. Confirme que la pila de papel de filtro está bien ubicada en la parte inferior del vial. Guarde los viales preparados en bandejas de plástico o cartón y colóquelos en bolsas de plástico grandes (~280 mm x 240 mm) hasta que las use. Construya una cámara de humedad cortando un agujero de 120 mm x 280 mm en la tapa de plástico de una tina de plástico de 606,24 mm x 225,42 mm x 403,22 mm (consulte la Tabla de materiales). Pegue la malla sobre el orificio para permitir el flujo de aire. Corte una sección de la rejilla de plástico de los paneles de luz de techo con persianas (originalmente 610 mm x 1220 mm) para que quepa en el fondo de la bañera de plástico utilizada en el paso 1.4.NOTA: Se puede usar una variedad de diferentes tinas de plástico y materiales de rejilla de plástico / metal para construir una cámara de humedad. 2. Cría de moscas Iniciar cultivos de moscas adultas (mínimo de 30 adultos) en botellas de leche de vidrio que contengan medios estándar del Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)31. Cierre las botellas con un tapón de rayón envuelto en una toallita de tareas delicadas. No llene las botellas.NOTA: El número de botellas requeridas depende del número de exposiciones químicas que se realicen y del genotipo de la cepa de prueba. Normalmente, se pueden obtener varios cientos de moscas de una sola botella cuando se utilizan poblaciones robustas y fecundas. El ensayo estándar utiliza moscas de tipo salvaje Oregon-R (BDSC stock #2057), pero cualquier genotipo de interés se puede usar con este protocolo. Recuerde que los genotipos comprometidos con baja fecundidad y/o viabilidad requieren un aumento de los cultivos en botella. Incubar las bandejas de botellas de cultivo a 25 °C con aproximadamente un 60% de humedad y un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 h hasta que se observe el tercer estadio larvario o etapas tempranas de la pupa. Esta etapa es identificable por la presencia de larvas vagando por los lados de la botella y la aparición de pupas en las paredes de la botella.NOTA: Solo maneje moscas durante el período de encendido de luces del ciclo de luz: oscuridad de 12:12 h. Para existencias robustas, las botellas alcanzan esta etapa después de 3-4 días en las condiciones descritas.Eliminar moscas adultas y determinar la liquidez de los medios. Si el medio fluye a lo largo del costado de la botella cuando está invertido, el medio es demasiado líquido. Inserte una toallita de tareas delicadas o una bola de rayón en el fondo de la botella para solidificar la comida para moscas. Cuando las moscas comiencen a cerrarse, retire a todos los adultos de las botellas y permita que las pupas continúen cerrándose durante 48 h. En este punto, cualquier adulto liberado de las botellas de cultivo puede transferirse a botellas nuevas para propagar las cepas (ver paso 2.1) o descartarse. Transfiera las moscas que se cierran en el período de 48 h a botellas nuevas que contienen medios BDSC estándar. Edad durante 3 días.NOTA: Los adultos en estos biberones tienen entre 3 y 5 días de edad y pueden usarse en los experimentos de letalidad y alimentación. Las botellas utilizadas para envejecer moscas adultas contendrán huevos y larvas. Como resultado, estas botellas se pueden utilizar para propagar la próxima generación de moscas. 3. Preparación de moscas para la exposición química Anestesiar moscas de 5 a 7 días de edad con CO2. Clasifique las moscas anestesiadas por sexo usando sus genitales. Para obtener ayuda con la anestesia y el sexado de moscas, consulte la referencia28. Coloque grupos de 20 moscas macho o 20 hembras en viales que contengan medios BDSC estándar. Cierre el vial con un tapón de rayón y guarde los viales masculino y femenino por separado. Marque los viales que contienen moscas hembras con una raya. Deje los viales con moscas macho sin marcar para evitar mezclar sexualmente accidentalmente.NOTA: El número de viales que deben prepararse en el paso 3.2 viene determinado por el tamaño de los experimentos de exposición. Como se describe en los pasos 5.3 y 5.6, un experimento típico de determinación de rango para una sola sustancia de ensayo requiere un mínimo de 40 viales de machos y 40 viales de hembras. Un experimento estándar de la curva dosis-respuesta, descrito en los pasos 7.4 y 7.8, requiere un mínimo de 63 viales de machos y 63 viales de hembras. Conservar los viales durante 48 h en una incubadora a 25 °C a aproximadamente un 60% de humedad y con un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 h. Durante este tiempo, apoye la bandeja de viales clasificados en un ángulo de 60 ° para evitar que las moscas se atasquen en la comida mientras se recuperan de la anestesia.NOTA: Este paso permite que las moscas se recuperen de la anestesia conCO2 . No vuelva a anestesiar a las moscas durante el resto del protocolo de exposición. Después del período de recuperación de 48 h, añadir 0,75 ml de agua purificada estéril a los viales preparados en el paso 1.3. El número de viales preparados en esta etapa debe ser idéntico al número de viales configurado en la etapa 3.2. Transfiera las moscas clasificadas y emparejadas por sexo al vial de inanición abriendo el vial de vidrio que contiene las moscas del paso 3.2, colocándolo en la boca del vial de plástico preparado y luego golpeando la parte inferior del vial de plástico contra una mesa de trabajo. Cierre el vial de plástico con un tapón de acetato de celulosa (comúnmente conocido como flug).Registre cualquier mosca perdida en esta transferencia (transfiérase a registros del número inicial de moscas para cada vial más adelante). Marque los viales de inanición que contienen moscas hembras con una raya. Deje los viales con moscas macho sin marcar para evitar mezclar sexualmente accidentalmente. Prepare la cámara de humedad para la exposición durante la noche. Consulte los pasos 1.4-1.5 para obtener una descripción de cómo construir esta cámara.Coloque seis toallas de papel estándar en el fondo de la cámara de humedad. Remoje las toallas de papel con 100 ml de agua. Coloque la rejilla de plástico (paso 1.5) sobre las toallas húmedas para asegurarse de que los viales no entren en contacto con las toallas de papel saturadas. Coloque las bandejas de los viales de inanición en posición horizontal dentro de las cámaras de humedad. Coloque las cámaras de humedad en una incubadora a 25 °C (aproximadamente al 60% de humedad) durante la noche.NOTA: Idealmente, el período de inanición durante la noche dura aproximadamente 16 h; Sin embargo, el tiempo se puede ajustar para los programas de laboratorio individuales. 4. Preparación de soluciones madre NOTA: Las moscas son alimentadas con productos químicos de prueba en un medio líquido de levadura y sacarosa. Esta sección describe la preparación de soluciones madre de medios de alimentación concentrados y productos químicos de prueba. Prepare una solución 4x de levadura y sacarosa que contenga 16% de sacarosa y 6% de extracto de levadura (m/v) (ver Tabla de materiales) disuelta en agua purificada estéril. Autoclave la solución en un ciclo líquido durante el tiempo de esterilización adecuado (por ejemplo, 40 min para 1 L).NOTA: La solución puede fabricarse a granel y almacenarse en alícuotas a -20 °C. Descongele las alícuotas individuales 1 día antes de su uso colocándolas en nevera a 4 °C. Prepare un stock de la sustancia de prueba. Para el experimento inicial, la solución madre debe hacerse a la concentración más alta para que el producto químico pueda disolverse completamente en agua.NOTA: Se pueden utilizar disolventes distintos del agua para disolver la sustancia problema. Consulte la discusión sobre las advertencias para el uso de solventes alternativos. Prepare una solución madre de colorante azul 100x disolviendo 1 g de FD&C Blue No. 1 (consulte la Tabla de materiales) en 10 ml de agua purificada estéril.NOTA: La solución madre de colorante azul puede fabricarse a granel y almacenarse en alícuotas a 4 °C. 5. Preparación de viales de exposición: experimento de determinación de rangos NOTA: Los pasos 5 y 6 del protocolo están diseñados para identificar la dosis más baja de sustancia de prueba que induce una letalidad del 100% y la dosis más alta que no induce un fenotipo letal. Si estas concentraciones ya están determinadas por experimentación previa, véanse los pasos 7 y 8 para calcular una curva dosis-respuesta. Los medios de exposición deben prepararse inmediatamente antes de añadir moscas a los viales de exposición. Etiquete ocho tubos centrífugos de 15 ml de la siguiente manera: (i) sin productos químicos, (ii) concentración más alta, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 y 1:1,000. Prepare los medios de exposición en los tubos de centrífuga etiquetados a partir del paso 5.1 agregando primero 2.5 ml de solución madre de levadura/sacarosa 4x a los ocho tubos etiquetados.Agregue 7.5 ml de agua purificada estéril al tubo etiquetado como “sin productos químicos”. Esta dilución es el control negativo. Agregue 7,4 ml de la solución madre química de prueba al tubo etiquetado como “concentración más alta”. Agregue 100 μL de agua purificada estéril a este tubo, de modo que el volumen final sea de 10 ml. Calcule y registre la molaridad de la sustancia problema en esta solución.NOTA: La adición de 100 μL de agua purificada estéril al tubo garantiza que la concentración química en este paso sea idéntica a la utilizada en el paso 5.5, donde se agrega una solución madre de colorante azul al medio de exposición como método para evaluar el comportamiento de alimentación. Agregue la cantidad adecuada de solución madre química de prueba y agua purificada estéril a los tubos restantes. El volumen final de cada tubo debe ser de 10 mL. La concentración final de sustancias químicas de ensayo en estos tubos en relación con el tubo de “concentración más alta” debe ser 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 y 1:1.000. Preparar y etiquetar ocho viales de exposición para cada concentración individual de medios de exposición generados en el paso 5.1. Debe haber ocho juegos de viales (64 viales en total) que contengan las siguientes etiquetas: sin producto químico, concentración más alta, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 y 1:1,000.Pipetear 0,75 ml de medios de exposición preparados en la etapa 5.2.3 en el conjunto correspondiente de viales de exposición. Etiquete ocho tubos individuales de 5 ml de la siguiente manera: (i) sin productos químicos, (ii) concentración más alta, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 y 1:1,000. Prepare los medios de exposición al colorante azul mezclando primero 500 μL de 4x solución madre de levadura/sacarosa y 20 μL de solución madre de colorante azul en ocho tubos de 5 ml marcados.Agregue 1.48 ml de agua purificada estéril al tubo etiquetado como “sin productos químicos”. Esta dilución es el control negativo. Agregue 1,48 ml de la solución madre de la sustancia química de prueba al tubo etiquetado como “concentración más alta”. No se agrega agua a este tubo. Calcule y registre la molaridad de la sustancia problema en esta solución. Agregue la cantidad adecuada de solución madre química de prueba y agua purificada estéril a los tubos restantes. El volumen final de cada tubo debe ser de 2 ml. La concentración final de sustancia de prueba en estos tubos en relación con el tubo de “concentración más alta” debe ser 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 y 1:1.000. Preparar y etiquetar dos viales de exposición con cada concentración individual de medios de exposición azules. Debe haber ocho juegos de viales (16 viales en total) que contengan las siguientes etiquetas: sin producto químico, concentración más alta, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 y 1:1,000. La palabra “azul” también debe escribirse en estos viales.Pipetear 0,75 ml de medio de exposición azul en el conjunto correspondiente de viales de exposición azul. 6. Exposición química de la mosca: experimento de búsqueda de rango Prepare viales de exposición química utilizando los viales de moscas hambrientas durante la noche a partir del paso 3.7 de la siguiente manera:Transfiera cuatro viales de moscas hembras hambrientas (20 moscas por vial) a cuatro viales de exposición de cada concentración química. Etiquete estos viales como “femeninos”. Utilice el mismo método de transferencia descrito en el paso 3.5. Transfiera cuatro viales de moscas macho hambrientas (20 moscas por vial) a cuatro viales de exposición de cada concentración química. Etiquete estos viales como “masculinos”. Utilice el mismo método de transferencia descrito en el paso 3.5. Prepare viales de exposición química que contengan colorante azul utilizando los viales de moscas hambrientas durante la noche a partir del paso 3.7 de la siguiente manera:Transfiera un vial de moscas hembras hambrientas (20 moscas por vial) a un vial de exposición azul para cada concentración química. Etiquete este vial como “hembra”. Utilice el mismo método de transferencia descrito en el paso 3.5. Transfiera un vial de moscas macho hambrientas (20 moscas por vial) a un vial de exposición azul para cada concentración química. Etiquete este vial como “masculino”. Utilice el mismo método de transferencia descrito en el paso 3.5. Registre el número de moscas que están presentes en cada vial después de la transferencia y anote el número que murió o escapó. Normalmente, las 20 moscas deberían sobrevivir durante la noche a la inanición y la transferencia. Coloque los viales de exposición horizontalmente en cámaras de humedad recién preparadas (ver paso 3.6 para la preparación de la cámara de humedad). Colocar las cámaras en una incubadora a 25 °C con aproximadamente un 60% de humedad y un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 h. Examinar los viales de exposición a las 24 y 48 h después del inicio de la exposición química. Cuente y registre el número de moscas muertas en cada vial en cada punto de tiempo.NOTA: La muerte se utiliza como lectura para este ensayo, pero el protocolo se puede adaptar para examinar otros fenotipos. Las moscas expuestas se recolectan comúnmente en estos puntos temporales para estudios transcriptómicos y metabolómicos. Examinar los viales de exposición azul a las 24 h después del inicio de la exposición química. Utilice las siguientes técnicas para determinar si las moscas expuestas consumieron el medio de exposición azul:Examine las paredes del vial en busca de indicios de heces azules, que aparecen como pequeños puntos en el lado del vial de exposición, así como en el flug. Anestesiar a las moscas con CO2 y examinar el abdomen para detectar la presencia de tinte azul.NOTA: Normalmente, los viales de exposición azul se analizan después de 24 h. Sin embargo, este paso podría realizarse a las 48 h, en su lugar. Las moscas que han comido normalmente tienen una franja azul a través del abdomen, lo que indica que el medio de exposición ha entrado en el intestino. Examine las moscas para detectar comportamientos de alimentación anormales, como regurgitación, distensión de los cultivos y ruptura de la función de barrera intestinal (indicada por la aparición de colorante azul en todo el organismo en lugar de limitarse al tracto gastrointestinal, comúnmente conocido como pitufo32,33). Deseche todos los viales, papel de filtro, flugs y moscas contaminados en recipientes apropiados para desechos químicos. Si quedan moscas vivas en los viales, congele los viales para matar las moscas antes de desecharlas en el contenedor de desechos adecuado.NOTA: La eliminación de los viales de exposición y las moscas está dictada por los productos químicos que se analizan en el experimento. Siga siempre los procedimientos de seguridad química descritos en la hoja de datos de seguridad química. Si las concentraciones utilizadas en el experimento de búsqueda de rango matan moscas a la dosis más baja, repita la sección 6 utilizando una serie de dilución, comenzando con la concentración más baja que mató al 100% de los animales. 7. Preparación de viales de exposición: Generación de una curva dosis-respuesta NOTA: El protocolo descrito en los pasos 5 y 6 está diseñado para determinar ampliamente la concentración química requerida para provocar un fenotipo. Los pasos 7 y 8 del protocolo se utilizan para calcular una curva dosis-respuesta precisa. Calcular las concentraciones de la sustancia de ensayo que deben analizarse para generar una curva dosis-respuesta utilizando el método siguiente:Determinar la concentración más baja de la sustancia de ensayo que mata al 100% de las moscas expuestas a las 48 h. Determinar la concentración más alta de sustancia problema que no tiene ningún efecto sobre la viabilidad a las 48 h. Calcular cuatro concentraciones adicionales que se distribuyan equitativamente entre las concentraciones determinadas en los pasos 7.1.1 y 7.1.2. Marcar nueve tubos centrífugos individuales de 15 ml con la molaridad de las concentraciones siguientes: i) ausencia de producto químico, ii) concentración determinada en la etapa 7.1.1, iii) concentración determinada en la etapa 7.1.2, iv) concentraciones determinadas en 7.1.3, v) dos veces la concentración determinada en la etapa 7.1.1, vi) dilución 1:2 de la concentración determinada en la etapa 7.1.2.NOTA: Para calcular con precisión la curva dosis-respuesta es importante incluir las concentraciones que son el doble de la concentración determinada en 7.1.1 y una dilución 1:2 de la determinada en la etapa 7.1.2. Prepare el medio de exposición agregando primero 2,5 ml de solución madre de levadura/sacarosa 4x a nueve tubos centrífugos individuales etiquetados de 15 ml preparados en el paso 7.2.Agregue 7.5 ml de agua purificada estéril al tubo etiquetado como “sin productos químicos”. Esta dilución es el control negativo. Agregue la cantidad adecuada de solución madre química de prueba y agua purificada estéril a los tubos restantes. El volumen final de cada tubo debe ser de 10 mL. La concentración final de sustancia química dentro de un tubo individual debe ser igual a la escrita en el exterior del tubo. Preparar y etiquetar 12 viales de exposición para cada concentración de medios de exposición generada en el paso 7.2. Debe haber nueve juegos de viales (108 viales en total). Pipetear 0,75 ml de medios de exposición en el conjunto correspondiente de viales de exposición.NOTA: Los pasos 7.6 a 7.8 son opcionales. Si se sabe que las concentraciones de la sustancia de ensayo preparadas en el paso 7.2 no afectan al comportamiento alimentado, se pueden omitir estos pasos. Preparar y etiquetar nueve tubos diferentes de 5 ml para medios de exposición azules con la misma serie de concentraciones utilizadas en el paso 7.2. Prepare los medios de exposición al colorante azul mezclando primero 500 μL de 4x solución madre de levadura/sacarosa y 20 μL de solución madre de colorante azul.Agregue 1.48 ml de agua estéril purificada al tubo etiquetado como “sin productos químicos”. Esta dilución es el control negativo. Añadir la cantidad adecuada de solución madre química de ensayo y agua estéril purificada a los tubos restantes. El volumen final de cada tubo debe ser de 2 mL. La concentración final de sustancia química dentro de un tubo individual debe ser igual a la escrita en el exterior del tubo. Preparar y etiquetar dos viales de exposición para cada concentración individual de medios de exposición azules. Debe haber nueve juegos de viales (18 viales en total), con cada conjunto de viales etiquetados con las concentraciones enumeradas en el paso 7.2. La palabra “azul” también debe escribirse en estos viales.Pipetear 0,75 ml de medio de exposición azul en el conjunto correspondiente de viales de exposición azul. 8. Exposición química de la mosca: generación de una curva dosis-respuesta Prepare viales de exposición química utilizando los viales de moscas hambrientas durante la noche a partir del paso 3.7 de la siguiente manera:Transfiera seis viales de moscas hembras hambrientas (20 moscas por vial) a seis viales de exposición de cada concentración química. Etiquete estos viales como “femeninos”. Utilice el mismo método de transferencia descrito en el paso 3.5. Transfiera seis viales de moscas macho hambrientas (20 moscas por vial) a seis viales de exposición de cada concentración química. Etiquete estos viales como “masculinos”. Utilice el mismo método de transferencia descrito en el paso 3.5. Prepare viales de exposición química que contengan colorante azul utilizando los viales de moscas hambrientas durante la noche a partir del paso 3.7 de la siguiente manera:Transfiera un vial de moscas hembras hambrientas (20 moscas por vial) a un vial de exposición azul para cada concentración química. Etiquete este vial como “hembra”. Utilice el mismo método de transferencia descrito en el paso 3.5. Transfiera un vial de moscas macho hambrientas (veinte moscas por vial) a un vial de exposición azul para cada concentración química. Etiquete este vial como “masculino”. Utilice el mismo método de transferencia descrito en el paso 3.5. Registre el número de moscas presentes en cada vial después de la transferencia. Normalmente, las 20 moscas deberían sobrevivir a la inanición y la transferencia durante la noche, pero asegúrese de que las que murieron o escaparon durante la transferencia se resten del total. Coloque los viales de exposición horizontalmente en cámaras de humedad recién preparadas (ver paso 3.6 para la preparación de la cámara de humedad). Colocar las cámaras en una incubadora a 25 °C con aproximadamente un 60% de humedad y un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 h. Examinar los viales de exposición a las 24 y 48 h después del inicio de la exposición química. Cuente y registre el número de moscas muertas en cada vial en cada punto de tiempo. Examinar los viales de exposición azul a las 24 h después del inicio de la exposición química. Utilice el método descrito en el paso 6.6 para evaluar los cambios en el comportamiento alimentario. Deseche todos los viales, papel de filtro, flugs y moscas contaminados en recipientes apropiados para desechos químicos. Si quedan moscas vivas en los viales, congele los viales para matar las moscas antes de desecharlas en el contenedor de desechos adecuado.NOTA: La eliminación de los viales de exposición y las moscas está dictada por los productos químicos que se analizan en el experimento. Siga siempre los procedimientos de seguridad química descritos en la hoja de datos de seguridad química. 9. Cálculo de una curva dosis-respuesta Utilice el software de dosis de referencia (BMDS, versión 3.2; consulte la Tabla de materiales) u otro software similar para analizar los datos34. A continuación se describe el flujo de trabajo que utiliza el software BMDS. Haga clic en la pestaña Datos de BMDS y haga clic en insertar nuevo conjunto de datos. Ingrese el número de muestras en el conjunto de datos, haga clic en dicotómico y, a continuación, haga clic en crear conjunto de datos. Escriba cada réplica como una fila individual en el conjunto de datos. Introduzca la dosis en la primera columna de la tabla generada, el número inicial de moscas excluyendo las que murieron o se perdieron antes del paso 8.3) en la segunda columna, y el número de moscas que murieron por exposición química en la tercera columna. Haga clic en la pestaña Principal de BMDS. Haga clic en la flecha desplegable para el menú Seleccionar tipo de modelo y haga clic en Dicotómico. Haga clic en habilitar para el conjunto de datos del paso 9.2 en la tabla Conjuntos de datos. Haga clic en los cuadros de los modelos deseados para el análisis en la tabla MLE y alternativas.NOTA: Se utilizó principalmente el modelo de Frequentist Restricted Dicotomous Hill. Haga clic en Ejecutar análisis. El programa generará un archivo de salida con la(s) curva(s) de letalidad y detalles adicionales sobre el(los) modelo(s).

Representative Results

La mosca ha servido durante mucho tiempo como modelo en estudios para determinar la toxicidad del arsenito de sodio (NaAsO2)35,36,37,38. Para demostrar la eficacia del protocolo, las moscas macho y hembra fueron expuestas a NaAsO2, con el objetivo de comparar estos resultados con estudios anteriores. Usando la metodología descrita anteriormente, los machos y hembras adultos de Oregon-R (BDSC stock #2057) fueron expuestos a un rango de concentraciones de NaAsO 2 (0, 0.01, 0.02, 0.1, 0.2, 1 y2 mM) y puntuaron para la letalidad 48 h después del inicio de la exposición (Figura 1A, B). El propósito de este análisis inicial fue identificar el rango aproximado de concentraciones que permitiera una caracterización más precisa de la toxicidad porNaAsO2. En experimentos posteriores, se seleccionaron concentraciones (0, 0.2, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 y 5 mM) que definieron con mayor precisión la curva dosis-respuesta de NaAsO2 (Figura 1C, D). Tenga en cuenta que el análisis resultante examinó varias concentraciones que indujeron una letalidad del 100%. Los datos se analizaron utilizando el software de dosis de referencia de la Agencia de Protección Ambiental disponible públicamente versión 3.2.0.125. Los datos se modelaron como “dicotómicos” y se utilizó el modelo de Dicotomous Hill para análisis posteriores. Según este modelo, las LD10, LD25 y LD 50 finales de moscas macho alimentadas con NaAsO2 fueron 0.30 mM,0.50 mM y 0.65 mM, respectivamente. Para las moscas hembras, estos valores fueron ligeramente superiores, con una DL10 de 0,30 mM, una LD25 de 0,65 mM y una LD50 de 0,90 mM. En general, los valores obtenidos utilizando este método son similares a los reportados previamente para la toxicidad por arsénico en el Drosophila melanogaster35,36,37,38, validando así la metodología. Además de las seis réplicas utilizadas para calcular la curva dosis-respuesta, las moscas macho y hembra también fueron alimentadas con soluciones de exposición a NaAsO2 que contenían 1% de azul FD&C, que es fácilmente visible en el tracto digestivo utilizando microscopía óptica. Basándose en la presencia de colorante azul en el intestino de moscas alimentadas con NaAsO 2, tanto las moscas macho como las hembras continuaron alimentándose 24 h después del comienzo de la exposición química, independientemente de la concentración de NaAsO 2 presente en el medio líquido (Figura 2). Sin embargo, se observó que el alimento ingerido ocasionalmente se regurgitaba a dosis superiores a 0,2 mM para las mujeres y 0,5 mM para los hombres (Figura 2). Estos hallazgos sugieren que la regurgitación podría desempeñar un papel clave en la respuesta de Drosophila al envenenamiento por arsénico. Figura 1: Curvas dosis-respuesta para Drosophila masculino y femenino tratados con NaAsO2 durante 48 h. Todos los gráficos muestran las proporciones estimadas de moscas muertas en cada concentración de NaAsO2 probada según el modelo de Dicotomous Hill. (A,B) Se probó un amplio rango de concentraciones de NaAsO2 para aproximarse a la dosis a la que cada sexo de mosca comienza a morir. (A) muestra los datos masculinos, y (B) muestra los datos femeninos. N = 4 viales, con 20 moscas por vial. (C,D) Se probó un rango más estrecho de concentraciones de NaAsO2 para determinar dosis precisas a las que murieron el 10%, 25% y 50% de cada sexo de moscas. Estas dosis se indican a la derecha de cada gráfico. (C) muestra los datos masculinos, y (D) muestra los datos femeninos. N = 6 viales, con 20 moscas por vial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Resultados representativos del ensayo de colorante azul de Drosophila macho y hembra tratados con NaAsO2 durante 24 h. Las micrografías muestran moscas alimentadas con concentraciones crecientes de NaAsO2. La fila (A) muestra moscas macho, y la fila (B) muestra moscas hembras, con la concentración de NaAsO2 aumentando de izquierda a derecha. El abdomen muestra una pequeña cantidad de azul cerca del tórax a bajas concentraciones, lo que indica que los medios de exposición entraron en el intestino. A concentraciones más altas, el tinte azul comienza a acumularse alrededor de la boca, lo que sugiere que los medios de exposición están siendo regurgitados. La barra de escala es de 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster está emergiendo como un poderoso sistema para NAMs16,18,19,21. Al aprovechar los recursos genéticos sin precedentes disponibles para la comunidad de moscas, combinados con los recientes avances en genómica y metabolómica, los estudios de seguridad química que utilizan Drosophila son capaces de identificar rápidamente los mecanismos moleculares por los cuales los compuestos individuales interfieren con el metabolismo, la fisiología y la señalización celular (por ejemplo, ver39). Este protocolo económico está diseñado para definir rápidamente curvas dosis-respuesta y, posteriormente, generar muestras para análisis de RNA-seq y metabolómica. Además, este protocolo flexible se puede adaptar para su uso con cualquier genotipo y puede acomodar muchas clases de productos químicos.

Un aspecto notable de este protocolo es la elección de los alimentos líquidos utilizados en la exposición química, que se basa en un estudio previo, pero difiere de los medios sólidos utilizados por la mayoría de los estudios toxicológicos de Drosophila 18,22. Este medio líquido específico fue seleccionado para reflejar el contenido nutricional del medio BDSC sólido estándar que las moscas también son alimentadas en este protocolo, para garantizar que las moscas reciban una nutrición consistente. La simplicidad de los medios de alimentación líquidos tiene muchas ventajas. Los medios líquidos son más fáciles de manejar que los alimentos sólidos, que deben fundirse y resolidificarse o reconstituirse a partir de polvo. Los medios líquidos también aumentan el rendimiento del sistema, aseguran una distribución química uniforme en todos los medios de alimentación y disminuyen el tiempo dedicado a trabajar con compuestos peligrosos. Además, el medio no requiere que las soluciones se calienten, lo que facilita la prueba de compuestos de prueba volátiles. Finalmente, debido a los relativamente pocos componentes incluidos en la solución alimenticia, las reacciones secundarias indeseables se minimizan entre el químico de prueba y otros componentes de la dieta. La levadura utilizada en los alimentos también está inactiva, lo que limita aún más la reactividad del medio de alimentación. Sin embargo, tenga en cuenta que el método no es adecuado para probar la toxicidad del desarrollo o larval.

Algunos de los materiales utilizados en el protocolo pueden ser sustituidos, como el uso de viales de mosca de vidrio en lugar de polipropileno. Sin embargo, los materiales utilizados se seleccionaron para ser inertes y desechables para evitar reacciones químicas no deseadas entre los reactivos y las exposiciones químicas que podrían resultar de la limpieza de la cristalería.

El uso de alimentos líquidos requiere un vehículo para la entrega de alimentos. El papel de filtro de acetato de celulosa fue seleccionado para este propósito debido a su flexibilidad y naturaleza inerte28. Otros investigadores utilizaron protocolos similares pero con otros vehículos, como toallitas de tareas delicadas o filtro de fibra de vidrio29,30. El papel de filtro de acetato de celulosa se adaptaba a estas necesidades porque es un vehículo inerte que se puede cortar a la forma ideal para encajarlo en el fondo de los viales de mosca sin grandes espacios entre el papel y la pared del vial, evitando la muerte debido a que las moscas se atasquen en el medio o en el propio vehículo.

Una limitación importante de este sistema es que la concentración máxima comprobable de un producto químico está ligada a la solubilidad del producto químico. Los compuestos no solubles en agua requieren un disolvente adicional, lo que puede conducir a efectos adicionales o sinérgicos con el producto químico de interés. Esto también puede crear situaciones en las que no es posible preparar soluciones madre lo suficientemente concentradas para alcanzar el punto final deseado en todos los organismos, limitando así el análisis de los datos resultantes31. Para abordar esto, los productos químicos con baja solubilidad en agua se pueden probar agregando hasta 0.5% de dimetilsulfóxido a la solución alimentaria. También se podrían usar otros solventes, pero se necesita investigación adicional para cada solvente de interés para determinar la concentración máxima aceptable de solvente dentro de la solución para maximizar la solubilidad y minimizar los efectos del solvente en el organismo.

Una extensa caracterización de la respuesta olfativa en Drosophila ha descrito cómo las moscas evitan consumir compuestos tóxicos40,41, lo que lleva a una alimentación reducida en los medios tratados. El ensayo de colorante azul aborda este fenómeno al permitir a los investigadores evaluar de manera eficiente los comportamientos de alimentación de las moscas alimentadas con cada concentración de sustancia química experimental42,43,44. La presencia o ausencia de azul en el tracto gastrointestinal de la mosca indica si la mosca ha estado comiendo el medio que contiene tóxico. Aunque existen métodos más sofisticados para evaluar los comportamientos de alimentación de moscas, como el contador de interacción líquido-alimento de mosca45, este método cualitativo es más adecuado para la detección de mayor rendimiento.

Un aspecto notable de este protocolo es que se ha optimizado para un período de exposición de 48 horas sin la necesidad de transferir moscas o agregar líquido adicional al vial de exposición. El uso de una cámara de humedad y la colocación de las cámaras en una incubadora mantenida a alta humedad evitaron que el papel de filtro que contenía los medios de alimentación se secara durante este período de tiempo. El protocolo se puede adaptar para duraciones de exposición más largas, pero el método debe ajustarse para garantizar que el papel de filtro no se seque y cause cambios significativos en la concentración de la solución o letalidad debido a la desecación.

Finalmente, una característica importante de este protocolo es que puede acomodar fácilmente variantes genéticas, lo que permite a los investigadores utilizar la amplia gama de herramientas genéticas para Drosophila para expandir estos estudios preliminares sobre organismos de tipo salvaje para comprender mejor los mecanismos de acción química in vivo. En este sentido, el protocolo descrito anteriormente podría modificarse fácilmente para complementar un protocolo JoVE previamente descrito por Peterson y Long que permite el análisis toxicológico de moscas capturadas en el medio silvestre18.

Debido a la amplia variedad de estudios previos sobre la toxicidad del arsenito de sodio en Drosophila 32,33,34,35,36, las moscas Oregon-R fueron tratadas con este compuesto para demostrar la eficacia de nuestro sistema. Las moscas macho exhibieron una LD 50 de 0,65 mM, y las hembras exhibieron una LD50 de 0,90 mM. Esto se alinea con estudios previos de Drosophila adulta tratada con arsenito de sodio. Por ejemplo, Goldstein y Babich37 encontraron que el 50% de las moscas (sexos mixtos) murieron después de 7 días de exposición a 0,5 mMNaAsO2. Aunque esta es una dosis ligeramente más baja que la observada actualmente, las diferencias entre sus métodos y este método (incluido el uso de medios de exposición sólidos, una escala de tiempo más larga y sexos mixtos) probablemente explican esta diferencia. Es importante destacar que ambos métodos dieron como resultado valores generales de DL50 similares.

Las observaciones de experimentos que utilizan este protocolo se pueden utilizar para encontrar objetivos genéticos y moleculares para estudios conductuales o mecanicistas posteriores. El método de exposición también se puede utilizar para tratar Drosophila para el muestreo de metabolómica y proteómica, lo que hace que este protocolo sea adecuado para el creciente campo de la toxicología de precisión (modelado a partir del campo de la medicina de precisión46). En este sentido, las moscas expuestas se pueden recolectar después del paso 8 para su posterior análisis genómico y metabolómico. Las muestras recolectadas en el paso 8 se pueden procesar, como se describe en Li y Tennessen47, comenzando con el paso 3.

En última instancia, los datos adquiridos de los experimentos descritos anteriormente, así como cualquier dato metabolómico y proteómico posterior, idealmente se utilizarían en comparaciones entre especies. Como se señaló anteriormente26, tales estudios entre especies son poderosos y capaces de determinar cómo los productos químicos individuales interfieren con las vías biológicas conservadas. Por lo tanto, el protocolo descrito anteriormente se puede utilizar para encontrar similitudes evolutivas en respuesta a tóxicos individuales a través de filos y ayudar a informar la regulación de la seguridad química.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a nuestro personal por su ayuda con las pruebas y optimización de este protocolo: Ameya Belamkar, Marilyn Clark, Alexander Fitt, Emma Rose Gallant, Ethan Golditch, Matthew Lowe, Morgan Marsh, Kyle McClung, Andy Puga, Darcy Rose, Cameron Stockbridge y Noelle Zolman. También agradecemos a nuestros colegas del Grupo de Toxicología de Precisión, particularmente a nuestros homólogos del Grupo de Exposición, por ayudar a identificar los objetivos del protocolo.

Este proyecto recibió financiación del programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el Acuerdo de Subvención No. 965406. El trabajo presentado en esta publicación se realizó como parte del Grupo ASPIS. Este resultado refleja únicamente las opiniones de los autores, y la Unión Europea no se hace responsable del uso que pueda hacerse de la información contenida en ellos. Esta publicación también fue posible gracias al apoyo del Instituto de Ciencias Clínicas y Traslacionales de Indiana, que está financiado en parte por el Premio Número UL1TR002529 de los Institutos Nacionales de Salud, Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales, Premio de Ciencias Clínicas y Traslacionales. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Partes de este proyecto fueron apoyadas por fondos de la Universidad de Indiana otorgados al JRS y al consorcio PhyloTox. JMH y EMP fueron apoyados por el P40OD018537 de premios de los NIH al Bloomington Drosophila Stock Center.

Materials

1.5 inch flower lever action craft punch Bira Craft HCP-115-024
15 mL Centrifuge Tubes  VWR 89039-666 High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL
2 ml Tubes  VWR 16466-044 Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom
5 ml Tubes  VWR  60818-576 Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps
50 mL Centrifuge Tubes  Corning  430290 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap
Benchmark Dose Software version 3.2 U.S. Environmental Protection Agency
Cardboard trays Genesee Scientific flystuff 32-122 trays and dividers for narrow vials 
CO2 gas pads Genesee Scientific flystuff 59-114 FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus 
Combitips advanced, 50 mL Eppendorf  0030089693 Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips
Cotton balls Genesee Scientific flystuff 51-101 Cotton balls, large, fits narrow vials 
Delicate task wipes Kimtech 34155 Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39"
Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) VWR 89168-888 Wide
FD&C Blue No. 1 Spectrum Chemical FD110 CAS number 3844-45-9
Flies  BDSC Stock #2057  OregonR wildtype 
Gloves (nitrile) Kimtech 55082/55081/55083 Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" 
Grade 1 CHR cellulose chromatography paper Cytvia 3001-917 Sheet, 46 x 57 cm
Mesh for humidity chamber
Multipette / Repeater (X) stream  Eppendorf  022460811 Repeater Xstream 
Plastic grate Plaskolite 18469 (from lowes) Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs
Plastic trays for glass vials Genesee Scientific flystuff 59-207 Narrow fly vial reload tray 
Polypropylene Drosophila Vial VWR 75813-156 Wide (28.5 mm)
Rubbermaid tubs Rubbermaid 3769017 (from Lowes) Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H
Sucrose ultra pure MP Biomedicals, Inc. 821721
Tube racks for wide-mouthed tubes Thermo scientific  5970-0230 Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes 
Water Purification System Millipore Milli-Q ZMQ560F01 Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier 
Yeast extract Acros Organics 451120050 CAS number 84604-16-0
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References

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Holsopple, J. M., Smoot, S. R., Popodi, E. M., Colbourne, J. K., Shaw, J. R., Oliver, B., Kaufman, T. C., Tennessen, J. M. Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (193), e65029, doi:10.3791/65029 (2023).
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