Génération de sporozoïtes génétiquement modifiés à Plasmodium berghei
Summary
Le paludisme est transmis par l’inoculation du stade sporozoïte de Plasmodium par des moustiques infectés. Le plasmodium transgénique nous a permis de mieux comprendre la biologie du paludisme et a contribué directement aux efforts de développement d’un vaccin contre le paludisme. Nous décrivons ici une méthodologie simplifiée pour générer des sporozoïtes transgéniques de Plasmodium berghei .
Abstract
Le paludisme est une maladie mortelle causée par le parasite Plasmodium et est transmis par la piqûre de moustiques anophèles femelles. Le stade sporozoïte de Plasmodium déposé par les moustiques dans la peau des hôtes vertébrés subit une phase de développement obligatoire dans le foie avant d’initier le paludisme clinique. Nous savons peu de choses sur la biologie du développement de Plasmodium dans le foie ; L’accès au stade de sporozoïte et la capacité de modifier génétiquement ces sporozoïtes sont des outils essentiels pour étudier la nature de l’infection à Plasmodium et la réponse immunitaire qui en résulte dans le foie. Nous présentons ici un protocole complet pour la génération de sporozoïtes transgéniques de Plasmodium berghei . Nous modifions génétiquement le stade sanguin de P. berghei et utilisons cette forme pour infecter les moustiques anophèles lorsqu’ils prennent un repas de sang. Une fois que les parasites transgéniques se sont développés chez les moustiques, nous isolons le stade sporozoïte du parasite des glandes salivaires des moustiques pour des expériences in vivo et in vitro . Nous démontrons la validité du protocole en générant des sporozoïtes d’une nouvelle souche de P. berghei exprimant la sous-unité 11 de la protéine fluorescente verte (GFP) (GFP11), et montrons comment elle pourrait être utilisée pour étudier la biologie du paludisme au stade hépatique.
Introduction
Malgré les progrès réalisés dans la mise au point de médicaments et la recherche sur la prévention et le traitement du paludisme, la charge mondiale du paludisme reste élevée. Plus d’un demi-million de personnes meurent du paludisme chaque année, les taux de mortalité les plus élevés étant observés chez les enfants vivant dans des régions où le paludisme est endémique, comme l’Afrique subsaharienne1. Le paludisme est causé par le parasite Plasmodium, qui est transmis à l’homme par la piqûre de moustiques anophèles femelles porteurs du parasite dans leurs glandes salivaires. Le stade infectieux de Plasmodium – les sporozoïtes – se déposent dans la peau des hôtes vertébrés lors d’un repas sanguin et voyagent dans la circulation sanguine pour infecter les cellules hépatiques, où ils subissent un développement obligatoire (constituant le paludisme pré-érythrocytaire) avant d’infecter les érythrocytes. L’infection des érythrocytes initie le stade sanguin du paludisme et est responsable de la totalité de la morbidité et de la mortalité associées à la maladie 2,3.
La nature obligatoire du développement pré-érythrocytaire de Plasmodium en a fait une cible attrayante pour les efforts de développement de vaccins et de médicaments prophylactiques4. L’accès aux sporozoïtes de Plasmodium est une condition préalable à l’étude de la biologie du paludisme pré-érythrocytaire, ainsi qu’à la mise au point de vaccins ou de médicaments ciblant le stade hépatique. De plus, notre capacité à générer des sporozoïtes de Plasmodium génétiquement modifiés a joué un rôle déterminant dans le succès de ces efforts de recherche 5,6,7,8,9. Des lignées transgéniques de Plasmodium exprimant des protéines rapporteures fluorescentes ou luminescentes nous ont permis de suivre leur développement in vivo et in vitro10,11. Les parasites génétiquement atténués (GAP), générés par la délétion de plusieurs gènes de Plasmodium, font également partie des candidats vaccins les plus prometteurs12,13.
Les modèles de paludisme chez les rongeurs et les primates non humains nous ont aidés à comprendre les mécanismes des interactions hôte-parasite dans le paludisme humain en raison des similitudes de la biologie et du cycle de vie entre les espèces de Plasmodium 14. L’utilisation d’espèces de Plasmodium qui infectent les rongeurs, mais pas les humains (p. ex., P. berghei) permet de maintenir le cycle de vie complet du parasite et de générer des sporozoïtes infectieux pour l’étude du paludisme au stade hépatique dans un contexte contrôlé de niveau de biosécurité 1. Il existe déjà divers protocoles distincts pour la génération de parasites transgéniques sanguins Plasmodium 15, l’infection des moustiques16 et l’isolement des sporozoïtes17. Nous décrivons ici un protocole complet combinant ces méthodologies afin de générer et d’isoler des sporozoïtes transgéniques de P. berghei, en utilisant la nouvelle souche transgénique PbGFP11 comme exemple. PbGFP 11 trafique le 11e β brin de la protéine fluorescente verte (GFP) super-dossier, GFP11, dans la vacuole parasitophore (PV) générée dans les hépatocytes de l’hôte. PbGFP 11 est utilisé en conjonction avec des hépatocytes transgéniques (fond Hepa1-6) exprimant des résidus qui constituent le fragment GFP 1-10 (GFP 1-10) dans le cytoplasme (cellules Hepa GFP 1-10). PbGFP11 rapporte la lyse PV dans les hépatocytes de l’hôte par auto-complémentation et la reformation de la GFP fonctionnelle et du signal de fluorescence vert18. Il convient de noter que GFP 11 est codé sous la forme d’une série de sept séquences en tandem dans PbGFP11 afin d’améliorer le signal de fluorescence résultant. En colorant les sporozoïtes PbGFP11 avec le colorant cytoplasmique CellTrace Violet (CTV), nous pouvons suivre les parasites. La lyse de ces parasites intracellulaires colorés par CTV entraîne elle-même une fuite de CTV dans le cytoplasme de la cellule hôte et une coloration de la cellule hôte. En plus de visualiser et de distinguer la lyse de Plasmodium PV et/ou du parasite dans les hépatocytes de l’hôte, ce système peut être utilisé de manière fiable pour étudier les voies immunitaires responsables de l’un ou l’autre de ces processus, par la perturbation génétique ou thérapeutique des composants moléculaires de ces voies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons utilisé le protocole ci-dessus dans notre laboratoire pour créer plusieurs lignées de parasites transgéniques P. berghei. Bien qu’il soit optimisé pour P. berghei, nous avons également utilisé avec succès ce protocole pour générer des sporozoïtes transgéniques de P. yoelii. Après avoir injecté les schizontes transfectés à des souris, les parasites sont généralement détectables au plus tard à 3 d.p.i. dans tous les groupes, y compris le témoin sans plasmide. La …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les AI168307 de subvention des National Institutes of Health à SPK. Nous remercions le noyau de cytométrie en flux CTEGD de l’UGA et le noyau de microscopie CTEGD de l’UGA. Nous reconnaissons également les contributions d’Ash Pathak, d’Anne Elliot et du personnel de l’UGA Sporocore dans l’optimisation du protocole. Nous tenons à remercier le Dr Daichi Kamiyama pour ses précieuses informations, ses discussions et les plasmides parents contenant la GFP11 et la GFP 1-10. Nous tenons également à remercier les membres du laboratoire Kurup pour leur soutien constant, leur patience et leurs encouragements.
Materials
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II – Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
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