遺伝子組換え マラリア原虫ベルヘイ ・スポロゾイトの生成
Summary
マラリアは、感染した蚊による マラリア原虫 のスポロゾイト段階の接種によって伝染します。トランスジェニックマラリア原虫は、マラリアの生物学をよりよく理解することを可能にし、 マラリア ワクチン開発の取り組みに直接貢献しています。ここでは、トランスジェニック マラリア原虫 のスポロゾイトを生成するための合理化された方法論について説明します。
Abstract
マラリアは寄生虫マラリア原虫によって引き起こされる致命的な病気で、メスのハマダラカに刺されることで感染します。脊椎動物の宿主の皮膚に蚊によって沈着したマラリア原虫のスポロゾイト段階は、臨床的マラリアを開始する前に肝臓で強制的な発達段階を経ます。肝臓でのマラリア原虫の発生の生物学についてはほとんどわかっていません。スポロゾイト段階へのアクセスと、そのようなスポロゾイトを遺伝子組み換えする能力は、マラリア原虫感染の性質とその結果生じる肝臓の免疫応答を研究するための重要なツールです。ここでは、トランスジェニックPlasmodium berghei sporozoitesを生成するための包括的なプロトコルを紹介します。私たちは、血液期のP. bergheiを遺伝子改変し、この形態を利用して、ハマダラカが血食を摂取すると感染します。トランスジェニック寄生虫が蚊の中で発生した後、蚊の唾液腺から寄生虫のスポロゾイト段階を単離し、in vivoおよびin vitro実験を行います。我々は、緑色蛍光タンパク質(GFP)サブユニット11(GFP11)を発現するP. bergheiの新規株のスポロゾイトを生成することにより、プロトコルの妥当性を実証し、肝臓期マラリアの生物学を調査するためにどのように使用できるかを示します。
Introduction
マラリアの予防と治療に関する医薬品開発と研究が進歩しているにもかかわらず、マラリアの世界的な疾病負担は依然として高いままです。毎年50万人以上がマラリアで死亡しており、サハラ以南のアフリカなどのマラリア蔓延地域に住む子どもたちの死亡率が最も高い1。マラリアは、寄生虫マラリア原虫によって引き起こされ、唾液腺に寄生虫を宿している雌のハマダラカに刺されることで人間に感染します。マラリア原虫の感染段階であるスポロゾイトは、血食中に脊椎動物の宿主の皮膚に沈着し、血流に乗って肝細胞に感染し、赤血球に感染する前に必須の発達(赤血球性マラリア前症を構成する)を受けます。赤血球の感染はマラリアの血期を開始し、この疾患に関連する罹患率と死亡率のすべてに関与しています2,3。
マラリア原虫の前赤血球発生の義務的な性質は、予防的ワクチンおよび医薬品開発の取り組みの魅力的な標的となっています4。前赤血球性マラリアの生物学を研究し、肝臓段階を標的とするワクチンや薬を開発するための前提条件は、マラリア原虫スポロゾイトへのアクセスです。さらに、遺伝子組み換えマラリア原虫スポロゾイトを生成する私たちの能力は、そのような研究努力の成功に役立っています5,6,7,8,9。蛍光または発光レポータータンパク質を発現するトランスジェニックマラリア原虫株は、in vivoおよびin vitroでその発生を追跡することを可能にしました10,11。マラリア原虫の複数の遺伝子の欠失によって生成される遺伝的弱毒化寄生虫(GAP)も、最も有望なワクチン候補の一部です12,13。
げっ歯類と非ヒト霊長類のマラリアモデルは、マラリア原虫種間の生物学とライフサイクルの類似性により、ヒトマラリアにおける宿主と寄生虫の相互作用のメカニズムを理解するのに役立っています14。げっ歯類には感染するがヒトには感染しないマラリア原虫種(例:P. berghei)の使用により、寄生虫のライフサイクル全体を維持し、肝臓期マラリアをバイオセーフティレベル1で研究するための感染性スポロゾイトの生成が可能になります。トランスジェニック血液段階のマラリア原虫の生成15、蚊の感染16、およびスポロゾイト17の単離については、すでにさまざまな個別のプロトコルが存在する。ここでは、新規トランスジェニック株PbGFP11を例に、トランスジェニックP.bergheiスポロゾイトを生成および分離するために、これらの方法論を組み合わせた包括的なプロトコルの概要を説明します。PbGFP 11は、スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質(GFP)の1 β 1本鎖であるGFP11を、宿主肝細胞で生成された寄生胞胞(PV)に輸送します。PbGFP 11は、細胞質(Hepa GFP 1-10細胞)においてGFP 1-10フラグメント(GFP 1-10)を構成する残基を発現するトランスジェニック肝細胞(Hepa1-6バックグラウンド)と組み合わせて使用されます。 PbGFP11は、機能的GFPおよび緑色蛍光シグナルの自己相補および再形成による宿主肝細胞におけるPV溶解を報告する18。注目すべきは、GFP11は、PbGFP11において一連の7つのタンデム配列としてコードされ、結果として生じる蛍光シグナルを増強することである。PbGFP11 スポロゾイトを細胞質色素CellTrace Violet(CTV)で染色すると、寄生虫を追跡することができます。このようなCTV染色された細胞内寄生虫の溶解自体が、CTVの宿主細胞質への漏出と宿主細胞の染色をもたらす。このシステムは、宿主肝細胞におけるマラリア原虫PVおよび/または寄生虫の溶解を視覚化および区別することに加えて、そのような経路の分子成分の遺伝的または治療的摂動を通じて、これらのプロセスのいずれかに関与する免疫経路を研究するために確実に使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちの研究室では、上記のプロトコルを使用して、トランスジェニック P.berghei 寄生虫の数系統を作成しました。 P. bergheiに最適化されていますが、このプロトコルを使用してトランスジェニックな P. yoelii sporozoitesを生成することにも成功しています。トランスフェクションしたシゾントをマウスに注入した後、寄生虫は通常、プラスミドなし対照を含むすべてのグル?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、SPKにAI168307された国立衛生研究所の助成金によって支援されました。 UGA CTEGD Flow Cytometry Core と UGA CTEGD Microscopy Core に感謝します。また、プロトコルの最適化におけるAsh Pathak氏、Anne Elliot氏、UGA Sporocoreのスタッフの貢献にも感謝します。貴重な洞察、議論、そしてGFP11およびGFP1-10を含む親プラスミドについて、神山大地博士に感謝します。また、Kurupラボの方々のご支援、忍耐、励ましに心より感謝申し上げます。
Materials
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II – Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
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