Echtzeitmessung des mitochondrialen bioenergetischen Profils von Neutrophilen

Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle in der Zellbioenergetik, die durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) Adenosintriphosphat (ATP) erzeugt. Darüber hinaus erstreckt sich die Rolle der Mitochondrien auf die Erzeugung und Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies, die Kalziumregulierung der zytoplasmatischen und mitochondrialen Matrix, die Zellsynthese, den Katabolismus und den Transport von Metaboliten innerhalb der Zelle¹. Die mitochondriale Atmung ist in allen Zellen unerlässlich, da ihre Funktionsstörung zu Stoffwechselproblemen 2 führen kann, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen³ und einer Vielzahl neurodegenerativer Erkrankungen wie altersbedingter Makuladegeneration⁴, Parkinson und Alzheimer⁵ und Charcot-Marie-Tooth-Krankheit² A (CMT2A)⁶.

Elektronenmikroskopische Untersuchungen an neutrophilen Granulozyten ergaben, dass es relativ wenige Mitochondrien gibt⁷, und sie sind für ihre Energieproduktion stark auf die Glykolyse angewiesen, da die mitochondrialen Atmungsraten sehr niedrig sind⁸. Mitochondrien sind jedoch entscheidend für neutrophile Funktionen, wie z. B. Chemotaxis⁹ und Apoptose^10,11,12. Eine frühere Studie zeigte ein komplexes mitochondriales Netzwerk in menschlichen Neutrophilen mit hohem Membranpotential. Der Verlust des mitochondrialen Membranpotentials ist ein Frühindikator für die Apoptose neutrophiler Granulozyten¹⁰. Die Behandlung mit mitochondrialem Entkoppler Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazon (CCCP) zeigte eine signifikante Hemmung der Chemotaxis, zusammen mit einer Veränderung der mitochondrialen Morphologie ^9,10.

Obwohl die primäre Energiequelle für neutrophile Granulozyten die Glykolyse ist, liefern die Mitochondrien das ATP, das die Aktivierung der neutrophilen Granulozyten einleitet, indem es die erste Phase der purinergen Signalübertragung antreibt, die Ca²⁺-Signalübertragung verstärkt, die mitochondriale ATP-Produktion verstärkt und die funktionellen Reaktionen der neutrophilen Granulozyten auslöst¹³. Eine Dysfunktion der mitochondrialen Atmungskette führt zu einer übermäßigen Produktion toxischer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und zu pathogenen Schäden 14,15,16. Die NETose, d. h. der Prozess der Bildung von extrazellulären Fallen (NETs) für neutrophile Granulozyten, ist eine wichtige Eigenschaft von Neutrophilen, die ihnen hilft, Krankheitserreger zu bekämpfen¹⁷ und zu vielen pathologischen Zuständen beiträgt, darunter Krebs, Thrombose und Autoimmunerkrankungen¹⁸. Mitochondriale ROS tragen zur NETose¹⁹ bei, mitochondriale DNA kann ein Bestandteil von NETs¹⁸ sein, und eine veränderte mitochondriale Homöostase beeinträchtigt die NETose 20,21,22,23,24. Darüber hinaus wird während der normalen Differenzierung oder Reifung die metabolische Reprogrammierung der neutrophilen Granulozyten durch die Begrenzung der glykolytischen Aktivität umgekehrt, und sie beteiligen sich an der mitochondrialen Atmung und mobilisieren intrazelluläre Lipide^25,26.

Der metabolische extrazelluläre Flussanalysator kann die mitochondriale Atmung und Glykolyse lebender Zellen kontinuierlich überwachen und quantifizieren. Der Analysator verwendet eine 96-Well-Sensorkartusche im Plattenformat und zwei Fluorophore, um die Sauerstoffkonzentration (O₂) und pH-Änderungen zu quantifizieren. Die Sensorkartusche befindet sich während des Assays über der Zellmonoschicht und bildet eine ~200 nm hohe Mikrokammer. Die Lichtwellenleiterbündel im Analysator werden verwendet, um die Fluorophore anzuregen und die Änderungen der Fluoreszenzintensität zu detektieren. Änderungen der_{O2-Konzentration} und des pH-Werts in Echtzeit werden automatisch berechnet und als Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) angezeigt. Die Sensorkartusche verfügt über vier Anschlüsse, über die während der Assay-Messungen bis zu vier Verbindungen in jede Vertiefung geladen werden können. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Quantifizierung der mitochondrialen Atmung von Maus und menschlichen Neutrophilen sowie der neutrophilenähnlichen HL60-Zellen mit dem metabolischen extrazellulären Flussanalysator.