JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Nötrofillerin mitokondriyal biyoenerjetik profilinin gerçek zamanlı ölçümü

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/64971
, ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program,Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology,University of Oklahoma Health Science Center

Summary

Metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin ve HL60 hücrelerinin mitokondriyal solunumunu ölçen kademeli protokolleri açıklıyoruz.

Abstract

Nötrofiller ilk savunma hattıdır ve insanlarda en bol bulunan lökositlerdir. Bu efektör hücreler fagositoz ve oksidatif patlama gibi işlevleri yerine getirir ve mikrobiyal klirens için nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET’ler) oluşturur. Nötrofillerin metabolik aktivitelerine ilişkin yeni anlayışlar, öncelikle glikolize dayandıkları erken kavramına meydan okuyor. Metabolik aktivitelerin hassas ölçümü, fizyolojik koşullar altında ve hastalık durumlarında trikarboksilik asit (TCA) döngüsü (Krebs döngüsü olarak da bilinir), oksidatif fosforilasyon (OXPHOS), pentoz fosfat yolu (PPP) ve yağ asidi oksidasyonu (FAO) dahil olmak üzere nötrofillerin farklı metabolik gereksinimlerini ortaya çıkarabilir. Bu yazıda, fare kemik iliği kaynaklı nötrofiller, insan kanından türetilmiş nötrofiller ve nötrofil benzeri HL60 hücre hattı üzerindeki mitokondriyal solunumun bir göstergesi olarak oksijen tüketim hızını (OCR) ölçmek için adım adım bir protokol ve ön gereksinimler, metabolik bir hücre dışı akı analizörü üzerinde metabolik akı analizi kullanılarak açıklanmaktadır. Bu yöntem, normal ve hastalık koşulları altında nötrofillerin mitokondriyal fonksiyonlarını ölçmek için kullanılabilir.

Introduction

Mitokondri, oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) ile adenozin trifosfat (ATP) üreten hücre biyoenerjetik maddelerinde önemli bir rol oynar. Buna ek olarak, mitokondrinin rolü, reaktif oksijen türlerinin üretilmesi ve detoksifikasyonuna, sitoplazmik ve mitokondriyal matriks kalsiyum regülasyonuna, hücresel senteze, katabolizmaya ve metabolitlerin hücre1 içinde taşınmasına kadar uzanır. Mitokondriyal solunum tüm hücrelerde esastır, çünkü işlev bozuklukları kardiyovasküler hastalıklar3 dahil olmak üzere metabolik sorunlara2 ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu4, Parkinson ve Alzheimer hastalıkları5 ve Charcot-Marie-Tooth hastalığı 2 A (CMT2A)6 gibi çok çeşitli nörodejeneratif hastalıklara neden olabilir.

Nötrofiller üzerinde yapılan elektron mikroskobik çalışmaları, nispeten az sayıda mitokondri7 olduğunu ve mitokondriyal solunum hızları çok düşük olduğu için enerji üretimi için glikolize büyük ölçüde güvendiklerini ortaya koymuştur8. Bununla birlikte, mitokondri, kemotaksis9 ve apoptoz10,11,12 gibi nötrofil fonksiyonları için çok önemlidir. Önceki bir çalışma, yüksek membran potansiyeline sahip insan nötrofillerinde karmaşık bir mitokondriyal ağ ortaya koymuştur. Mitokondriyal membran potansiyel kaybı, nötrofil apoptozunun erken bir göstergesidir10. Mitokondriyal uncoupler karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon (CCCP) ile tedavi, mitokondriyal morfolojide bir değişiklik ile birlikte kemotaksiste önemli inhibisyon göstermiştir 9,10.

Nötrofiller için birincil enerji kaynağı glikoliz olmasına rağmen, mitokondri, Ca2 + sinyallemesini artıran, mitokondriyal ATP üretimini artıran ve nötrofil fonksiyonel yanıtlarını başlatan pürinerjik sinyallemenin ilk aşamasını besleyerek nötrofil aktivasyonunu başlatan ATP’yi sağlar13. Mitokondriyal solunum zincirinin disfonksiyonu, toksik reaktif oksijen türlerinin (ROS) aşırı üretimine neden olur ve patojenik hasarlara yol açar14,15,16. Nötrofil hücre dışı tuzakları (NET’ler) oluşturma süreci olan NETosis, nötrofillerin patojenlere karşı savaşmalarına yardımcı olan kritik bir özelliktir17 ve kanser, tromboz ve otoimmün bozukluklar18 dahil olmak üzere birçok patolojik duruma katkıda bulunur. Mitokondriyal kaynaklı ROS, NETosis19’a katkıda bulunur, mitokondriyal DNA, NETs18’in bir bileşeni olabilir ve değiştirilmiş mitokondriyal homeostaz, NETosis 20,21,22,23,24’ü bozar. Ayrıca, normal farklılaşma veya olgunlaşma sırasında, nötrofil metabolik yeniden programlama, glikolitik aktiviteyi sınırlayarak tersine döner ve mitokondriyal solunuma katılır ve hücre içi lipitleri harekete geçirir25,26.

Metabolik hücre dışı akı analizörü, canlı hücre mitokondriyal solunumu ve glikolizi sürekli olarak izleyebilir ve ölçebilir. Analizör, oksijen (O2) konsantrasyonunu ve pH değişikliklerini ölçmek için 96 delikli plaka formatlı bir sensör kartuşu ve iki florofor kullanır. Sensör kartuşu, tahlil sırasında hücre tek katmanının üzerindedir ve ~ 200 nm yüksekliğinde bir mikro oda oluşturur. Analizördeki optik fiber demetleri, floroforları uyarmak ve floresan yoğunluğu değişikliklerini tespit etmek için kullanılır. O2 konsantrasyonu ve pH’daki gerçek zamanlı değişiklikler otomatik olarak hesaplanır ve oksijen tüketim oranı (OCR) ve hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) olarak gösterilir. Sensör kartuşunda, tahlil ölçümleri sırasında her bir kuyucuğa dört adede kadar bileşiğin yüklenmesine izin veren dört bağlantı noktası vardır. Bu protokol, metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin mitokondriyal solunumunun yanı sıra nötrofil benzeri HL60 hücrelerinin ölçülmesine odaklanır.

Protocol

Heparinize edilmiş tam kan örnekleri, Helsinki Deklarasyonu’na uygun olarak UConn Health Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandığı gibi, bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra sağlıklı insan bağışçılarından alınmıştır. Tüm hayvan deneyleri, UConn Sağlık Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönergelerini izledi ve kemirgenlerin kullanımı için onay, Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu’nda belirtilen kriterler…

Representative Results

Fare nötrofillerinin oligomisin, FCCP ve rotenon / antimisin A karışımına (Şekil 3A), insan nötrofillerine (Şekil 3B) ve farklılaşmamış ve farklılaşmış HL60 hücrelerine (Şekil 3C) yanıt olarak mitokondriyal solunum değişikliklerini gösteren temsili OCR dinamikleri gösterilmiştir. Tüm hücrelerde, oligomisin tedavisi, ATP sentazın proton kanalını inhibe ederek OCR değerini düşürür; FCCP tedavisi, memb…

Discussion

Metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak nötrofillerin mitokondriyal solunumunu ölçen standart prosedür, hücre sayısı, hücre büyümesi ve canlılık gibi birçok faktörle sınırlıdır. Her bileşik konsantrasyonu, bu tahlildeki hücrelerin tipi ve kaynağı arasında değişir. Oligomisin ve rotenon / antimisin A, çoğu hücre tipi arasında çoğunlukla benzer konsantrasyonda kullanılır. Bununla birlikte, FCCP kaynaklı maksimum solunum hızı farklı hücreler arasında değiştiğinden, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

UConn Health İmmünoloji Bölümü’nden Dr. Anthony T. Vella ve Dr. Federica Aglianoin’e metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanma konusundaki eğitimleri için ve UConn Health İmmünoloji Bölümü’nden Dr. Lynn Puddington’a enstrümanlara verdiği destek için teşekkür ederiz. UConn Tıp Fakültesi’nden Dr. Geneva Hargis’e bu makalenin bilimsel yazımı ve düzenlenmesindeki yardımları için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (R01HL145454), Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (R35GM147713 ve P20GM139763), UConn Health’ten bir başlangıç fonu ve Amerikan İmmünologlar Birliği’nden bir Kariyer yeniden giriş bursu ile desteklenmiştir.

Materials

37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136 (2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858 (2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472 (2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521 (2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121 (2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444 (2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487 (2021).
  30. Zhang, Z. -. W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907 (2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850 (2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465 (2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656 (2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845 (2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975 (2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079 (2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. . Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019)
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899 (2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020)
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608 (2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856 (2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099 (2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer’s disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306 (2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

Tags

Mitochondrial RespirationNeutrophilsHL60 CellsMetabolic Extracellular Flux AnalyzerMitochondrial FunctionCell Seeding DensityAssay MediumMouse NeutrophilsHuman NeutrophilsDifferentiated HL60 CellsUndifferentiated HL60 CellsBackground Correction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image