Chromatin-Immunpräzipitation im Nesseltier-Modellsystem Exaiptasia diaphana
Summary
Es wird ein Chromatin-Immunpräzipitationsassay (X-ChIP) gegen die Histonmarkierung H3K4me3 für den Modellorganismus Exaiptasia diaphana vorgestellt. Die Spezifität und Wirksamkeit des Assays werden durch quantitative PCR und Next-Generation-Sequencing bestätigt. Dieses Protokoll ermöglicht die verstärkte Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der Seeanemone E. diaphana.
Abstract
Posttranslationale Histonmodifikationen (PTMs) und andere epigenetische Modifikationen regulieren die Zugänglichkeit von Genen zum Transkriptionsapparat und beeinflussen so die Fähigkeit eines Organismus, auf Umweltreize zu reagieren. Die Chromatin-Immunpräzipitation in Verbindung mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) wird häufig eingesetzt, um Protein-DNA-Wechselwirkungen in den Bereichen Epigenetik und Genregulation zu identifizieren und zu kartieren. Das Gebiet der Nesseltier-Epigenetik wird jedoch durch einen Mangel an anwendbaren Protokollen behindert, was zum Teil auf die einzigartigen Eigenschaften von Modellorganismen wie der symbiotischen Seeanemone Exaiptasia diaphana zurückzuführen ist, deren hoher Wassergehalt und Schleimmengen molekulare Methoden behindern. Hier wird ein spezialisiertes ChIP-Verfahren vorgestellt, das die Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen bei der Genregulation von E. diaphana ermöglicht. Die Vernetzungs- und Chromatinextraktionsschritte wurden für eine effiziente Immunpräzipitation optimiert und anschließend durch die Durchführung von ChIP mit einem Antikörper gegen die Histonmarkierung H3K4me3 validiert. Anschließend wurde die Spezifität und Wirksamkeit des ChIP-Assays durch Messung der relativen Belegung von H3K4me3 um mehrere konstitutiv aktivierte Genorte mittels quantitativer PCR und durch Next-Generation-Sequencing für die genomweite Analyse bestätigt. Dieses optimierte ChIP-Protokoll für die symbiotische Seeanemone E. diaphana ermöglicht die Untersuchung der Protein-DNA-Wechselwirkungen, die an der Reaktion von Organismen auf Umweltveränderungen beteiligt sind, die symbiotische Nesseltiere, wie z.B. Korallen, betreffen.
Introduction
Der Bericht des Weltklimarats (IPCC) aus dem Jahr 2022 hebt hervor, dass trotz wachsender Sensibilisierung und Bemühungen zur Eindämmung des Klimawandels immer intensivere und häufigere Hitzewellen im Meer die Korallenriffe einem hohen Risiko für großflächige Bleiche und Massensterben in den nächsten Jahrzehnten aussetzen1. Um die Bemühungen zum Schutz und zur Wiederherstellung von Korallenriffen zu unterstützen, werden die aktuellen und prognostizierten Auswirkungen sich ändernder Umweltbedingungen auf benthische Nesseltiere auf mehreren biologischen Ebenen untersucht, um die zugrunde liegenden Mechanismen von Reaktion und Resilienzzu verstehen 2.
Die Verfügbarkeit von Untersuchungsinstrumenten, die auf benthische Nesseltiere anwendbar sind, ist von entscheidender Bedeutung, um dieser Herausforderung zu begegnen, und die Entwicklung dieser Werkzeuge erfordert aktive Anstrengungen zur Weitergabe von Wissen und Technologien, die in anderen Bereichen etabliert wurden, auf Meeresorganismen3. Die Hürden bei der Arbeit mit vielen Korallenarten werden teilweise durch den Einsatz von Modellsystemen wie der Seeanemone Exaiptasia diaphana (allgemein als Aiptasia bezeichnet)4 abgebaut. Diese schnellwüchsigen, fakultativ symbiotischen Seeanemonen sind unter Laborbedingungen relativ einfach zu halten, vermehren sich sowohl sexuell als auch asexuell und es fehlt das Kalziumkarbonat-Skelett5. Das frei zugängliche Referenzgenom5 von E. diaphana ermöglicht den Einsatz epigenetischer Methoden, die eine Sequenzierung erfordern. Merkmale wie ein hoher Wassergehalt, eine Schleimproduktion und geringe Gewebemengen pro Individuum stellen jedoch eine Herausforderung für die Etablierung replizierbarer Protokolle dar, wodurch die epigenetische Forschung an E. diaphana und anderen Nesseltieren mit ähnlichen Merkmalen eingedämmt wird.
Epigenetische Modifikationen können den Phänotyp verändern, ohne die genomische Nukleotidsequenz eines Organismus zu verändern, indem sie Chromatin-assoziierte Prozesse regulieren6. Die epigenetische Regulation von Nesseltieren wird hauptsächlich im Kontext der Evolutionsgeschichte und -entwicklung 7,8,9,10, der Etablierung und Aufrechterhaltung von Symbiosen 11,12,13 und der Reaktion auf Umweltveränderungen14,15 untersucht.. Insbesondere wurden Variationen in den Mustern der DNA-Methylierung, die in den meisten Fällen die Hinzufügung einer Methylgruppe zu einer Cytosinbase beinhalten, als Reaktion auf sich ändernde Umweltbedingungen wie die Erwärmung13 und die Versauerung der Ozeane16 beobachtet. Es wurde auch gezeigt, dass DNA-Methylierungsmuster intergenerationell vererbbar sind, was die Rolle der Epigenetik bei der Akklimatisierung von Korallen an Umweltstressoren unterstreicht17. Im Vergleich zur DNA-Methylierung gab es relativ wenige Studien zu anderen wichtigen epigenetischen Regulatoren, wie z. B. nicht-kodierenden RNAs 11,18,19, Transkriptionsfaktoren 9,10 oder posttranslationalen Histonmodifikationen (PTMs) bei Nesseltieren20. Die Untersuchung von DNA-assoziierten Proteinen ist besonders anspruchsvoll, da die verfügbaren Methoden den Zugang zu einem Referenzgenom des Studienorganismus erfordern und aufgrund der großen Stichprobengrößen und der benötigten Antikörper mit hoher Spezifität teuer sind3. Mit einer Vielzahl chemischer Gruppen, die PTMs an spezifischen Histonresten bilden, bleibt das Verständnis der Chromatinmodifikationslandschaften bei Nesseltieren, insbesondere im Zusammenhang mit drohenden Umweltbelastungen, eine große Herausforderung.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Untersuchung von Histon-PTMs, Histonvarianten und anderen Chromatin-assoziierten Proteinen bei Nesseltieren voranzutreiben, indem ein optimiertes Chromatin-Immunpräzipitationsprotokoll (ChIP) für das Korallenmodell E. diaphana vorgestellt wird (Originalprotokoll von Bodega et al.21). ChIP kann mit quantitativer PCR kombiniert werden, um locusspezifische Protein-DNA-Interaktionen zu charakterisieren, oder mit Next-Generation-Sequencing (NGS), um diese Interaktionen über das gesamte Genom hinweg abzubilden. Im Allgemeinen werden Proteine und DNA reversibel vernetzt, so dass das Protein of Interest (POI) an denselben Locus gebunden bleibt, mit dem es in vivo assoziiert ist. Während die im Säugetiermodellsystem weit verbreitete Vernetzungsmethode in der Regel bei Raumtemperatur auf 15 Minuten oder darunter gehalten wird, wurde der Vernetzungsansatz optimiert, damit das Formaldehyd den von E. diaphana produzierten Schleim effektiver durchdringen kann. Das Gewebe wird dann in flüssigem Stickstoff schockgefroren, homogenisiert und lysiert, um die Zellkerne aus den Zellen zu extrahieren. Der Materialverlust in diesen Schritten wird vermieden, indem nur ein Lysepuffer verwendet wird und dann direkt zur Beschallung übergegangen wird, bei der das Chromatin in ~300 bp lange Fragmente fragmentiert wird. Diese Fragmente werden mit einem für den POI spezifischen Antikörper bis auf PTM-Niveau inkubiert. Der Antikörper-Protein-DNA-Immunkomplex wird mit Hilfe von magnetischen Beads gefällt, die an die primären Antikörper binden und dabei nur die DNA-Abschnitte auswählen, die mit dem POI assoziiert sind. Nach der Cross-Link-Umkehr und der Reinigung des Niederschlags können die gewonnenen DNA-Segmente für die qPCR oder den Aufbau einer DNA-Bibliothek für die Sequenzierung verwendet werden, um die Segmente auf ein Referenzgenom abzubilden und so die Loci zu identifizieren, mit denen der POI assoziiert ist. Weitere Einzelheiten zu den Überlegungen für die einzelnen Schritte finden Sie in Jordán-Pla und Visa22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gemäß dem obigen Protokoll wurde die gewonnene DNA erfolgreich für die ChIP-qPCR und ChIP-Seq verwendet. Das gleiche allgemeine Peakprofil für H3K4me3, das zuvor von anderen Organismen 26,27,28 berichtet wurde, wurde hier erhalten, mit dem höchsten Peak um das TSS und einer hohen Anreicherung an den erwarteten Stellen in der ChIP-qPCR. Die relativ hohe Anzahl von mehrfach kartierten Reads in den ChIP-Seq-Daten könnte durch PCR-Duplikate verursacht worden sein. Die Anzahl der eindeutig kartierten Reads könnte durch Änderungen am Protokoll zur Vorbereitung der DNA-Bibliothek erhöht werden, um PCR-Duplikate zu reduzieren. Es gibt mehrere Normalisierungsmethoden für ChIP-qPCR-Daten, wobei die hier vorgestellte Methode des prozentualen Anteils der Eingabe häufiger verwendet wird. Bei dieser Methode werden die IP- und Mock-Samples direkt auf die Eingabe normalisiert, mit dem Nachteil, dass die Eingabe während der ChIP anders verarbeitet wird als die IP- und Mock-Samples, was zu Fehlern führen kann. Die alternative Fold-Anreicherungsmethode normalisiert das Signal des IP basierend auf dem Signal des Mocks unter Verwendung der gleichen Primer-Sätze, wodurch ein Signal-über-Hintergrund-Verhältnis entsteht. Die Signalintensität der Mock-Stichprobe kann jedoch stark variieren, was wiederum große Auswirkungen auf die Daten hat. Eine ausführliche Diskussion der ChIP-qPCR und der Datennormalisierung findet sich in Haring et al.29.
Eine wesentliche Änderung der oben vorgestellten Methode im Vergleich zu gängigen ChIP-Protokollen ist die viel längere Vernetzungszeit, von etwa 15 Minuten für Histonproteine bis hin zu einer Inkubation über Nacht. Das Hauptziel dieser Anpassung ist es, das Eindringen des Fixiermittels Formaldehyd durch die Schleimschicht in das tiefere Gewebe von E. diaphana zu erleichtern, um die Protein-DNA-Wechselwirkungen im Zellkern zu erhalten. Die Optimierung dieses Schritts ist entscheidend, um eine ausreichende Vernetzung zu gewährleisten, um die Protein-DNA-Wechselwirkungen zu erhalten, ohne dass die Vernetzung durch Ultraschall so stark erfolgt, dass die Scherung des Chromatins durch Beschallung unwirksam wird. Die Zugabe von Reinigungsmitteln wie SDS kann auch die Beschallungseffizienz erhöhen29. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass eine lange Inkubation mit Formaldehyd den Homogenisierungsschritt erleichtert und zu einer feiner und gleichmäßiger gemahlenen Probe im Vergleich zu frischen oder gefrorenen Anemonen führte, die vor dem Vernetzungsschritt homogenisiert wurden. Die empfohlenen Bereiche der Fragmentlängen variieren zwischen 100 bp und 1.000 bp29,30 und können vom Zielprotein abhängen. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass jeder Benutzer die Beschallungsbedingungen optimiert, um die gewünschte Fragmentlänge mit so wenig Beschallungsleistung wie möglich zu erreichen, da eine Überbeschallung die Proteine denaturieren und somit das IP31 beeinträchtigen kann. Eine weitere Einschränkung von ChIP ist die benötigte Materialmenge, die insbesondere relativ kleine Organismen wie Anemonen betrifft; Dieses Problem wurde behoben, indem der Probenverlust zwischen den Schritten reduziert wurde. Nach der Homogenisierung der Probe wurde sie sofort lysiert, wodurch mehrere übliche Schritte der Kernpräparation entfielen. Der Probenpool von 20 Anemonen enthielt im Allgemeinen genügend Chromatin für drei IPs und sowohl Mock- als auch Input-Kontrollen. Die Menge des Ausgangsmaterials (d.h. die Anzahl der Anemonen) könnte in Zukunft weiter reduziert werden, insbesondere bei einer ChIP mit nur einem Zielprotein. Je nach der beabsichtigten nachgelagerten Methode sollten die Kontrollen angepasst werden; für ChIP-qPCR sollte erwogen werden, zusätzliche Kontrollen29 einzuschließen, während für ChIP-seq der Mock zugunsten einer Eingabekontrolle weggelassen werden kann.
Obwohl die Antikörpervalidierung außerhalb des Rahmens dieses Protokolls liegt und daher hier nur kurz angesprochen wurde, ist sie ein kritischer Schritt vor der Durchführung von ChIP. Insbesondere bei der Verwendung kommerzieller Antikörper an wirbellosen Spezies kann die Verfügbarkeit von spezifischen Antikörpern für die gewünschten Ziele eine Einschränkung darstellen. Im ersten Schritt wurde die H3-N-terminale Schwanzsequenz von E. diaphana und anderen Modellorganismen, einschließlich Zebrafischen und Mäusen, verglichen und für hoch konserviert befunden12. Die Antikörperspezifität wurde dann mittels Immunfluoreszenz getestet, bei der die Signale der Nukleinsäure und des Antikörpers kolokalisiert wurden. Das aus den Sequenzierungsdaten gewonnene Peak-Profil von H3K4me3 um das TSS gibt weitere Sicherheit hinsichtlich der Spezifität des Antikörpers.
Eine weitere Überlegung in Bezug auf die Antikörperspezifität ist die Möglichkeit einer Wechselwirkung mit den symbiotischen Dinoflagellaten, die E. diaphana sowie viele andere Anthozoen in ihren Zellen beherbergen. Transkriptomanalysen in Dinoflagellaten der Gattungen Lingulodinium32 und Symbiodinium33 haben histonkodierende Gene gefunden, darunter Kernhiston H3 und mehrere H3-Varianten bei niedrigen Expressionsniveaus, und das Ausmaß der funktionellen Konservierung des Histoncodes ist unklar34. Marinov und Lynch34 verglichen die Sequenzkonservierung von N-terminalen Schwänzen der H3-Variante innerhalb und zwischen Dinoflagellaten-Arten, und Symbiodiniaceae-Arten zeigten eine hohe Divergenz um Lysin 4 in der Schwanzsequenz, insbesondere wenn man die Kongruenz benachbarter Aminosäuren zu Lysin 4 als Faktor berücksichtigt. Es wurde auch gezeigt, dass sich diese Region von anderen Modellarten wie Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster und Saccharomyces cerevisiae unterscheidet, die mit der Sequenz von E. diaphanaübereinstimmen 12. Daher ist das Risiko einer unbeabsichtigten Wechselwirkung des Antikörpers gegen H3K4me3 mit dem Dinoflagellaten H3 gering. Darüber hinaus sind die Sequenzen nur auf das Genom von E. diaphana ausgerichtet, und die qPCR-Primer sollten spezifisch für E. diapana-Sequenzen sein, um eine zusätzliche Filtrationsschicht für unbeabsichtigt ausgefällte Sequenzen zu bieten.
Das vorgestellte ChIP-Protokoll liefert ausreichend DNA für die qPCR sowie für die Sequenzierung der nächsten Generation, und obwohl wahrscheinlich eine individuelle Optimierung durch jeden Benutzer erforderlich sein wird, bietet es einen Ausgangspunkt für die verstärkte Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen in benthischen Nesseltieren, möglicherweise im Zusammenhang mit Symbiose und Umweltveränderungen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nichts.
Materials
| 1 kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10787018 | |
| 100% Ethanol | |||
| 15 mL falcon tubes | |||
| 16% Formaldehyde Solution (w/v), Methanol-free | Thermo scientific | 28906 | |
| 5 mL tube | |||
| 5PRIME Phase Lock tubes | Quantabio | 2302820 | Phase lock gel – light |
| AGANI needle 25 G | Terumo | AN*2516R1 | |
| Agarose | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Bowtie | open source, available from https://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml | ||
| Branson sonifier 250 | Branson | Sonicator | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430 R | With rotors for 15 mL and 1.5 mL tubes |
| ChIP-grade antibody (here polyclonal H3K4me3 antibody) | Diagenode | C15410003 | |
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | 2 tablets/mL water for 100x stock |
| Cover glass | vwr | 48393 194 | |
| Disposable Spatula | vwr | 80081-188 | |
| DNA purification kit (here QIAGEN QIAquick PCR purification kit) | QIAGEN | 28104 | |
| Dounce tissue grinder | Wheaton | tight pestle | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) 1x | gibco | 14190-094 | |
| Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10004D | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Electrophoresis system | |||
| Ethidium bromide | |||
| FASTQC v0.11.9 | software | ||
| Gel Doc EZ Documentation System | Bio-Rad | 1708270 | Gel imaging system |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | |
| Injekt-F Tuberculin syringe 1 mL | B. Braun | 9166017V | |
| Linear acrylamide (5 mg/mL) | Invitrogen | AM9520 | |
| Low-retention 1.5 mL tube | |||
| Magnetic separation rack | for 1.5 mL tubes | ||
| Microscope | |||
| Microscope slide | |||
| Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) | open source | ||
| Mortar and pestle, porcelain | |||
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | Thermo scientific | ND-2000C | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma-Aldrich | 61739 | |
| Nuclease-free water | |||
| Pasteur pipette | |||
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Mixture (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Proteinase K (20 mg/mL) | Ambion | AM2546 | |
| Purple Loading Dye 6x | New England BioLabs | B7024S | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| RNase Cocktail Enzyme Mix | Invitrogen | AM2286 | RNase A = 500 U/mL, RNase T1 = 20000 U/mL |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
| TAE buffer | |||
| Thermomixer | Eppendorf | 5384000012 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| Triton X-100 solution | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | Danger: may cause cancer. Suspected of damagin fertility or the unborn child |
| Tube rotator SB3 | Stuart | ||
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Vacuum pump |
References
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