الترسيب المناعي للكروماتين في نظام نموذج Cnidarian Exaiptasia diaphana
Summary
يتم تقديم مقايسة الترسيب المناعي للكروماتين (X-ChIP) مقابل علامة الهستون H3K4me3 للكائن النموذجي Exaiptasia diaphana . يتم تأكيد خصوصية وفعالية الفحص من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي وتسلسل الجيل التالي. يتيح هذا البروتوكول زيادة التحقيق في تفاعلات البروتين والحمض النووي في شقائق النعمان البحرية E. diaphana.
Abstract
تنظم تعديلات هيستون ما بعد الترجمة (PTMs) والتعديلات اللاجينية الأخرى إمكانية وصول الكروماتين للجينات إلى آلية النسخ ، مما يؤثر على قدرة الكائن الحي على الاستجابة للمحفزات البيئية. تم استخدام الترسيب المناعي للكروماتين إلى جانب التسلسل عالي الإنتاجية (ChIP-seq) على نطاق واسع لتحديد ورسم خرائط تفاعلات البروتين والحمض النووي في مجالات علم التخلق وتنظيم الجينات. ومع ذلك ، فإن مجال علم التخلق cnidarian يعوقه عدم وجود بروتوكولات قابلة للتطبيق ، ويرجع ذلك جزئيا إلى السمات الفريدة للكائنات الحية النموذجية مثل شقائق النعمان البحرية التكافلية Exaiptasia diaphana ، التي يعيق محتواها المائي العالي وكميات المخاط الطرق الجزيئية. هنا ، يتم تقديم إجراء ChIP متخصص ، مما يسهل التحقيق في تفاعلات البروتين والحمض النووي في تنظيم الجينات E. diaphana . تم تحسين خطوات الربط المتقاطع واستخراج الكروماتين من أجل الترسيب المناعي الفعال ثم التحقق من صحتها عن طريق إجراء ChIP باستخدام جسم مضاد ضد علامة الهستون H3K4me3. في وقت لاحق ، تم تأكيد خصوصية وفعالية مقايسة ChIP من خلال قياس الإشغال النسبي ل H3K4me3 حول العديد من مواقع الجينات المنشطة بشكل أساسي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي وتسلسل الجيل التالي لتحليل النطاق على نطاق الجينوم. يسهل بروتوكول ChIP المحسن هذا لشقائق النعمان البحرية التكافلية E. diaphana التحقيق في تفاعلات البروتين والحمض النووي المشاركة في استجابات الكائنات الحية للتغيرات البيئية التي تؤثر على cnidarians التكافلية ، مثل الشعاب المرجانية.
Introduction
يسلط تقرير عام 2022 الصادر عن الهيئة الحكومية الدولية المعنية بتغير المناخ (IPCC) الضوء على أنه على الرغم من تزايد الوعي وجهود التخفيف ، فإن موجات الحر البحرية المتزايدة الكثافة والمتكررة تعرض الشعاب المرجانية لخطر كبير من التبييض واسع النطاق والوفيات الجماعية خلال العقود القادمة1. من أجل إبلاغ جهود الحفاظ على الشعاب المرجانية واستعادتها ، يتم التحقيق في الآثار الحالية والمتوقعة للظروف البيئية المتغيرة على الكائنات البحرية القاعية على مستويات بيولوجية متعددة لفهم الآليات الأساسية للاستجابة والقدرة على الصمود2.
ويعد توافر أدوات التحري التي تنطبق على الكائنات القاعية أمرا بالغ الأهمية لمواجهة هذا التحدي، ويتطلب تطوير هذه الأدوات جهدا نشطا لنقل المعارف والتكنولوجيات القائمة في ميادين أخرى إلى الكائنات البحرية3. يتم تخفيف العقبات التي تحول دون العمل مع العديد من الأنواع المرجانية جزئيا باستخدام أنظمة نموذجية ، مثل شقائق النعمان البحرية Exaiptasia diaphana (يشار إليها عادة باسم Aiptasia)4. من السهل نسبيا الاحتفاظ بشقائق النعمان البحرية سريعة النمو والتكافلية اختياريا في ظروف المختبر ، وتتكاثر جنسيا ولا جنسيا ، وتفتقر إلى الهيكل العظمي لكربونات الكالسيوم5. يسهل الجينوم المرجعي المفتوحالوصول 5 من E. diaphana استخدام الطرق اللاجينية التي تتطلب التسلسل. ومع ذلك ، فإن ميزات مثل المحتوى المائي العالي ، وإنتاج المخاط ، وكميات الأنسجة المنخفضة لكل فرد تشكل تحديات أمام إنشاء بروتوكولات قابلة للتكرار ، وبالتالي الحد من الأبحاث اللاجينية على E. diaphana وغيرها من cnidarians مع ميزات مماثلة.
يمكن للتعديلات اللاجينية أن تغير النمط الظاهري دون تغيير تسلسل النوكليوتيدات الجينومية للكائن الحي عن طريق تنظيم العمليات المرتبطة بالكروماتين6. يتم التحقيق في التنظيم اللاجيني Cnidarian في الغالب في سياقات التاريخ التطوري والتنمية7،8،9،10 ، إنشاء التكافل وصيانته11،12،13 ، والاستجابة للتغيرات البيئية14،15. على وجه التحديد ، لوحظت اختلافات في أنماط مثيلة الحمض النووي ، والتي تنطوي في معظم الحالات على إضافة مجموعة ميثيل إلى قاعدة السيتوزين ، استجابة للظروف البيئية المتغيرة مثلالاحترار 13 وتحمض المحيطات16. كما ثبت أن أنماط مثيلة الحمض النووي قابلة للتوريث بين الأجيال ، مما يؤكد دور علم التخلق في التأقلم المرجاني مع الضغوطات البيئية17. بالمقارنة مع مثيلة الحمض النووي ، كانت هناك دراسات قليلة نسبيا حول منظمات جينية مهمة أخرى ، مثل الحمض النووي الريبي غير المشفر11،18،19 ، أو عوامل النسخ9،10 ، أو تعديلات هيستون بعد الترجمة (PTMs) في cnidarians20. إن التحقيق في البروتينات المرتبطة بالحمض النووي يتطلب بشكل خاص لأن الطرق المتاحة تتطلب الوصول إلى جينوم مرجعي للكائن الحي للدراسة وهي مكلفة بسبب أحجام العينات الكبيرة والأجسام المضادة عالية الخصوصية اللازمة3. مع وجود مجموعة واسعة من المجموعات الكيميائية التي تشكل PTMs في بقايا هيستون محددة ، فإن فهم المناظر الطبيعية لتعديل الكروماتين في cnidarians ، خاصة في سياق الضغوط البيئية الوشيكة ، لا يزال يمثل تحديا كبيرا.
الهدف من هذا العمل هو تعزيز التحقيق في PTMs هيستون ، ومتغيرات الهستون ، والبروتينات الأخرى المرتبطة بالكروماتين في cnidarians من خلال تقديم بروتوكول الترسيب المناعي للكروماتين الأمثل (ChIP) لنموذج المرجان E. diaphana (البروتوكول الأصلي بواسطة Bodega et al.21). يمكن دمج ChIP مع تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لتوصيف تفاعلات البروتين والحمض النووي الخاصة بالموقع أو تسلسل الجيل التالي (NGS) لرسم خريطة لهذه التفاعلات عبر الجينوم بأكمله. بشكل عام ، ترتبط البروتينات والحمض النووي بشكل عكسي بحيث يظل البروتين محل الاهتمام (POI) مرتبطا بنفس الموضع المرتبط به في الجسم الحي. في حين أن طريقة الربط المتقاطع الشائعة المستخدمة على نطاق واسع في نظام نموذج الثدييات عادة ما يتم الاحتفاظ بها لمدة 15 دقيقة أو أقل في درجة حرارة الغرفة ، فقد تم تحسين نهج الربط المتقاطع للسماح للفورمالديهايد باختراق المخاط الذي تنتجه E. diaphana بشكل أكثر فعالية. ثم يتم تجميد الأنسجة في النيتروجين السائل ، وتجانسها ، وتحللها لاستخراج النوى من الخلايا. يتم تجنب فقدان المواد في هذه الخطوات باستخدام مخزن مؤقت واحد فقط للتحلل ثم الانتقال مباشرة إلى الصوتنة ، مما يؤدي إلى تفتيت الكروماتين إلى شظايا طويلة ~ 300 bp. يتم تحضين هذه الشظايا بجسم مضاد خاص ب POI وصولا إلى دقة مستوى PTM. يتم ترسيب المركب المناعي للجسم المضاد والبروتين والحمض النووي باستخدام حبات مغناطيسية ترتبط بالأجسام المضادة الأولية ، وبالتالي اختيار أجزاء الحمض النووي المرتبطة بنقاط الاهتمام فقط. بعد انعكاس الارتباط المتقاطع وتنظيف الراسب ، يمكن استخدام شرائح الحمض النووي الناتجة لبناء qPCR أو مكتبة الحمض النووي للتسلسل لتعيين الأجزاء إلى جينوم مرجعي ، وبالتالي تحديد المواقع التي يرتبط بها POI. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول اعتبارات كل خطوة في Jordán-Pla و Visa22.
Protocol
Representative Results
Discussion
باتباع البروتوكول أعلاه ، تم استخدام الحمض النووي الذي تم الحصول عليه بنجاح ل ChIP-qPCR و ChIP-Seq. تم الحصول على نفس ملف تعريف الذروة العام ل H3K4me3 الذي تم الإبلاغ عنه سابقا من الكائنات الحيةالأخرى 26،27،28 هنا ، مع أعلى قمة حول TSS وتخصيب عالي في المواقع المتوقعة في ChIP-qPCR. قد يكون العدد الكبير نسبيا من القراءات المعينة المضاعفة في بيانات ChIP-Seq ناتجا عن تكرارات تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن زيادة مقدار القراءات المعينة بشكل فريد عن طريق التغييرات في بروتوكول إعداد مكتبة الحمض النووي لتقليل تكرارات تفاعل البوليميراز المتسلسل. هناك العديد من طرق التطبيع لبيانات ChIP-qPCR ، مع استخدام النسبة المئوية لطريقة الإدخال المعروضة هنا بشكل أكثر شيوعا. تعمل هذه الطريقة على تطبيع IP والعينات الوهمية مباشرة إلى الإدخال ، مع عيب أن الإدخال تتم معالجته بشكل مختلف عن IP وعينات وهمية أثناء ChIP ، مما قد يؤدي إلى حدوث أخطاء. تعمل طريقة إثراء الطي البديلة على تطبيع إشارة IP بناء على إشارة الوهمية باستخدام نفس مجموعات التمهيدي ، مما يعطي نسبة إشارة عبر الخلفية. ومع ذلك ، يمكن أن تختلف شدة إشارة العينة الوهمية بشدة ، والتي بدورها لها تأثيرات كبيرة على البيانات. يمكن العثور على مناقشة مفصلة حول ChIP-qPCR وتطبيع البيانات في Haring et al.29.
التعديل الرئيسي في الطريقة المعروضة أعلاه مقارنة ببروتوكولات ChIP الشائعة هو وقت الربط المتقاطع الأطول بكثير ، من حوالي 15 دقيقة لبروتينات هيستون إلى حضانة بين عشية وضحاها. الهدف الرئيسي من هذا التعديل هو تسهيل تغلغل الفورمالديهايد المثبت من خلال طبقة المخاط في الأنسجة العميقة ل E. diaphana للحفاظ على تفاعلات البروتين والحمض النووي داخل النواة. يعد تحسين هذه الخطوة أمرا بالغ الأهمية لضمان الربط المتقاطع الكافي للحفاظ على تفاعلات البروتين والحمض النووي دون الربط المتقاطع لدرجة أن قص الكروماتين عن طريق الصوتنة يصبح غير فعال. إضافة المنظفات مثل SDS يمكن أن تزيد من كفاءة صوتنة كذلك29. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على حضانة طويلة مع الفورمالديهايد لتسهيل خطوة التجانس وأسفرت عن عينة أرضية أكثر دقة وتوازنا مقارنة بشقائق النعمان الطازجة أو المجمدة التي تم تجانسها قبل خطوة الربط المتقاطع. تتراوح النطاقات الموصى بها لأطوال الشظايا بين 100 نقطة أساس و 1000 نقطة أساس29,30 وقد تعتمد على البروتين المستهدف. من الأهمية بمكان أن يقوم كل مستخدم بتحسين ظروف الصوتنة للوصول إلى طول الجزء المطلوب بأقل قدر ممكن من قوة الصوتنة ، لأن الإفراط في الصوتنة قد يفسد البروتينات ، وبالتالي يؤثر على IP31. ومن القيود الأخرى على ChIP كمية المواد المطلوبة، التي تؤثر بشكل خاص على الكائنات الصغيرة نسبيا مثل شقائق النعمان؛ تمت معالجة هذه المشكلة عن طريق تقليل فقدان العينة بين الخطوات. بعد تجانس العينة ، تم تحليلها على الفور ، وبالتالي حذف العديد من خطوات تحضير النوى الشائعة. احتوت مجموعة العينات التي تم الحصول عليها من 20 شقائق النعمان بشكل عام على ما يكفي من الكروماتين لثلاثة عناوين IP وعناصر تحكم وهمية وإدخال. يمكن تقليل كمية المواد الأولية (أي عدد شقائق النعمان) في المستقبل ، خاصة عند إجراء ChIP مع بروتين مستهدف واحد فقط. اعتمادا على طريقة المصب المقصودة ، يجب تعديل الضوابط ؛ بالنسبة إلى ChIP-qPCR ، يجب اعتباره يتضمن عناصر تحكم إضافية29 ، بينما بالنسبة ل ChIP-seq ، يمكن حذف الوهمية لصالح عنصر تحكم الإدخال.
في حين أن التحقق من صحة الأجسام المضادة خارج نطاق هذا البروتوكول ، وبالتالي ، تم التطرق إليه لفترة وجيزة فقط هنا ، إلا أنه خطوة حاسمة قبل إجراء ChIP. خاصة عند استخدام الأجسام المضادة التجارية على أنواع اللافقاريات ، يمكن أن يكون توافر أجسام مضادة محددة للأهداف المرجوة قيدا. في الخطوة الأولى ، تمت مقارنة تسلسل ذيل H3 N-terminal ل E. diaphana والكائنات النموذجية الأخرى ، بما في ذلك الزرد والفئران ، ووجد أنه محفوظ للغاية12. ثم تم اختبار خصوصية الجسم المضاد باستخدام التألق المناعي ، الذي شارك في تحديد إشارات الحمض النووي والجسم المضاد. يعطي ملف تعريف الذروة ل H3K4me3 حول TSS الذي تم الحصول عليه من بيانات التسلسل مزيدا من الثقة فيما يتعلق بخصوصية الجسم المضاد.
هناك اعتبار آخر فيما يتعلق بخصوصية الأجسام المضادة وهو إمكانية حدوث أي تفاعل مع الدينوفلاجيلات التكافلية التي تستضيفها E. diaphana ، بالإضافة إلى العديد من الأنثوزوان الأخرى ، في خلاياها. وجدت تحليلات Transcriptome في dinoflagellates من أجناس Lingulodinium32 و Symbiodinium33 جينات ترميز الهستون ، بما في ذلك هيستون H3 الأساسي والعديد من متغيرات H3 عند مستويات تعبير منخفضة ، ومدى الحفظ الوظيفي لشفرة هيستون غير واضح34. قارن مارينوف ولينش34 حفظ تسلسل ذيول N-terminal المتغيرة H3 داخل وبين أنواع الدينوفلاجيلات ، وأظهرت أنواع Symbiodiniaceae اختلافا كبيرا حول ليسين 4 في تسلسل الذيل ، خاصة عند النظر في تطابق الأحماض الأمينية المجاورة مع ليسين 4 كعامل. كما تبين أن هذه المنطقة تختلف عن الأنواع النموذجية الأخرى مثل Arabidopsis thaliana و Drosophila melanogaster و Saccharomyces cerevisiae ، والتي تتطابق مع تسلسل E. diaphana12. لذلك ، فإن خطر التفاعل غير المقصود للجسم المضاد ضد H3K4me3 مع دينوفلاجيلات H3 منخفض. بالإضافة إلى ذلك ، يتم محاذاة التسلسلات فقط مع جينوم E. diaphana ، ويجب أن تكون بادئات qPCR خاصة بتسلسلات E. diaphana ، مما يوفر طبقة إضافية من الترشيح لأي تسلسلات مترسبة عن غير قصد.
ينتج بروتوكول ChIP المقدم حمضا نوويا كافيا ل qPCR بالإضافة إلى تسلسل الجيل التالي ، وبينما من المحتمل أن يكون التحسين الفردي من قبل كل مستخدم مطلوبا ، فإنه يوفر نقطة انطلاق لزيادة التحقيق في تفاعلات البروتين والحمض النووي في cnidarians القاعية ، ربما في سياق التكافل والتغيرات البيئية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي.
Materials
| 1 kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10787018 | |
| 100% Ethanol | |||
| 15 mL falcon tubes | |||
| 16% Formaldehyde Solution (w/v), Methanol-free | Thermo scientific | 28906 | |
| 5 mL tube | |||
| 5PRIME Phase Lock tubes | Quantabio | 2302820 | Phase lock gel – light |
| AGANI needle 25 G | Terumo | AN*2516R1 | |
| Agarose | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Bowtie | open source, available from https://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml | ||
| Branson sonifier 250 | Branson | Sonicator | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430 R | With rotors for 15 mL and 1.5 mL tubes |
| ChIP-grade antibody (here polyclonal H3K4me3 antibody) | Diagenode | C15410003 | |
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | 2 tablets/mL water for 100x stock |
| Cover glass | vwr | 48393 194 | |
| Disposable Spatula | vwr | 80081-188 | |
| DNA purification kit (here QIAGEN QIAquick PCR purification kit) | QIAGEN | 28104 | |
| Dounce tissue grinder | Wheaton | tight pestle | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) 1x | gibco | 14190-094 | |
| Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10004D | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Electrophoresis system | |||
| Ethidium bromide | |||
| FASTQC v0.11.9 | software | ||
| Gel Doc EZ Documentation System | Bio-Rad | 1708270 | Gel imaging system |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | |
| Injekt-F Tuberculin syringe 1 mL | B. Braun | 9166017V | |
| Linear acrylamide (5 mg/mL) | Invitrogen | AM9520 | |
| Low-retention 1.5 mL tube | |||
| Magnetic separation rack | for 1.5 mL tubes | ||
| Microscope | |||
| Microscope slide | |||
| Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) | open source | ||
| Mortar and pestle, porcelain | |||
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | Thermo scientific | ND-2000C | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma-Aldrich | 61739 | |
| Nuclease-free water | |||
| Pasteur pipette | |||
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Mixture (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Proteinase K (20 mg/mL) | Ambion | AM2546 | |
| Purple Loading Dye 6x | New England BioLabs | B7024S | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| RNase Cocktail Enzyme Mix | Invitrogen | AM2286 | RNase A = 500 U/mL, RNase T1 = 20000 U/mL |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
| TAE buffer | |||
| Thermomixer | Eppendorf | 5384000012 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| Triton X-100 solution | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | Danger: may cause cancer. Suspected of damagin fertility or the unborn child |
| Tube rotator SB3 | Stuart | ||
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Vacuum pump |
References
- Pörtner, H. -. O. 2022: Summary for Policymakers. Climate Change 2022: Impacts, Adaptation, and Vulnerability. Contribution of Working Group II to the Sixth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , (2022).
- Cziesielski, M. J., Schmidt-Roach, S., Aranda, M. The past, present, and future of coral heat stress studies. Ecology and Evolution. 9 (17), 10055-10066 (2019).
- Eirin-Lopez, J., Putnam, H. Marine environmental epigenetics. Annual Review of Marine Science. 11, 335-368 (2021).
- Rädecker, N. Using Aiptasia as a model to study metabolic interactions in cnidarian-Symbiodinium symbioses. Frontiers in Physiology. 9 (214), (2018).
- Baumgarten, S. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. PNAS. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Schwaiger, M. Evolutionary conservation of the eumetazoan gene regulatory landscape. Genome Research. 24 (4), 639-650 (2014).
- Zhang, X., Jacobs, D. A broad survey of gene body and repeat methylation in cnidaria reveals a complex evolutionary history. Genome Biology and Evolution. 14 (2), evab284 (2022).
- Schwaiger, M. An ancestral Wnt-Brachyury feedback loop in axial patterning and recruitment of mesoderm-determining target genes. Nature Ecology & Evolution. 6 (12), 1921-1939 (2022).
- Ozment, E., et al. Cnidarian hair cell development illuminates an ancient role for the class IV POU transcription factor in defining mechanoreceptor identity. Elife. 10, e74336 (2021).
- Baumgarten, S., et al. Evidence for miRNA-mediated modulation of the host transcriptome in cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Molecular Ecology. 27 (2), 403-418 (2018).
- Li, Y. DNA methylation regulates transcriptional homeostasis of algal endosymbiosis in the coral model Aiptasia. Science Advances. 4 (8), eaat2142 (2018).
- Rodriguez-Casariego, J. A., Cunning, R., Baker, A. C., Eirin-Lopez, J. M. Symbiont shuffling induces differential DNA methylation responses to thermal stress in the coral Montastraea cavernosa. Molecular Ecology. 31 (2), 588-602 (2021).
- Putnam, H. M., Davidson, J. M., Gates, R. D. Ocean acidification influences host DNA methylation and phenotypic plasticity in environmentally susceptible corals. Evolutionary Applications. 9 (9), 1165-1178 (2016).
- Weizman, E., Levy, O. The role of chromatin dynamics under global warming response in the symbiotic coral model Aiptasia. Communications Biology. 2, 282 (2019).
- Liew, Y. J. Epigenome-associated phenotypic acclimatization to ocean acidification in a reef-building coral. Science Advances. 4 (6), eaar8028 (2018).
- Liew, Y. J. Intergenerational epigenetic inheritance in reef-building corals. Nature Climate Change. 10 (3), 254-259 (2020).
- Liew, Y. J., et al. Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata. PLoS One. 9 (3), e91101 (2014).
- Huang, C., et al. Identification of long non-coding RNAs in two anthozoan species and their possible implications for coral bleaching. Scientific Reports. 7, 5333 (2017).
- Rodriguez-Casariego, J. A., et al. Coral epigenetic responses to nutrient stress: Histone H2A.X phosphorylation dynamics and DNA methylation in the staghorn coral Acropora cervicornis. Ecology and Evolution. 8 (23), 12193-12207 (2018).
- Bodega, B., et al. A cytosolic Ezh1 isoform modulates a PRC2-Ezh1 epigenetic adaptive response in postmitotic cells. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (5), 444-452 (2017).
- Jordán-Pla, A., Visa, N., Visa, N., Jordán-Pla, A. Considerations on experimental design and data analysis of chromatin immunoprecipitation experiments. Chromatin Immunoprecipitation., edited by Visa, N., Jordán-Pla, A. , 9-28 (2017).
- . ENCODE. Ren Lab ENCODE Tissue Fixation and Sonication Protocol for MicroChIP Available from: https://www.encodeproject.org/documents/ (2023)
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, R25 (2009).
- Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nature Protocols. 7, 1728-1740 (2012).
- Howe, F. S., Fischl, H., Murray, S. C., Mellor, J. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. BioEssays. 39 (1), e201600095 (2017).
- Zhang, Z., Shi, L., Dawany, N., Kelsen, J., Petri, M. A., Sullivan, K. E. H3K4 tri-methylation breadth at transcription start sites impacts the transcriptome of systemic lupus erythematosus. Clinical Epigenetics. 8, 14 (2016).
- Li, X. High-resolution mapping of epigenetic modifications of the rice genome uncovers interplay between DNA methylation, histone methylation, and gene expression. The Plant Cell. 20, 2-276 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2014).
- Landt, S. G. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Raha, D., Hong, M., Snyder, M. ChIP-Seq: A method for global identification of regulatory elements in the genome. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, Unit 21.19.1-Unit 21.19.14 (2010).
- Roy, S., Morse, D. A full suite of histone and histone modifying genes are transcribed in the dinoflagellate Lingulodinium. PLoS One. 7 (4), e34340 (2012).
- Bayer, T., et al. Symbiodinium transcriptomes: Genome insights into the dinoflagellate symbionts of reef-building corals. PLoS One. 7 (4), e35269 (2012).
- Marinov, G. K., Lynch, M. Diversity and divergence of dinoflagellate histone proteins. G3 Genes, Genomes, Genetics. 6 (2), 397-422 (2016).
