拡大顕微鏡を用いたショウ ジョウバエ の胚全体拡大による超解像イメージング

このプロトコルは、ショウ ジョウバエなどの無脊椎動物の研究に関するアーカンソー大学(UARK)のガイドラインに従っており、UARK機関バイオセーフティ委員会(プロトコル#20001)によって承認されました。 1. ショウジョウバエ の胚の固定とデビテリン化 注:ステップ1では、胚を囲む透明な不透過膜であるビテリン膜を手動で除去するための手順(手剥離)について説明します。重要なことは、手作業で剥離することで、ExMプロトコルの開始時に適切にステージングされた胚を選択できるため、ExMプロトコルの終了時に使用可能な向きの胚を得る可能性が大幅に高まることです。ただし、このExMプロトコルは、大量の胚採取およびビテリン膜のメタノールベースの除去のための標準的な手順と完全に互換性があり、その場合はステップ2(免疫蛍光標識)に直接スキップできます。 細いガラス針を何本か用意するか、購入します。針先の実際の寸法は重要ではありませんが、針が固定胚の硝子体膜を突き刺すのに十分な硬さと鋭さがあることを確認してください。胚マイクロインジェクション用の針を準備するように、マイクロピペットプーラーを使用してガラスキャピラリーチューブ(外径1mm、内径0.75mm)から針を作ります18。または、事前に引っ張られた針を購入します。 標準的な ショウジョウバエ 技術19 を使用して、>100匹の成虫の ショウジョウバエ をフルーツジュース/寒天プレート20で密封された通気性のあるプラスチックカップに入れることにより、胚を収集します。時限収集ウィンドウを使用して、適切なステージ16の胚を濃縮します。例えば、原腸形成(ステージ6)と収束伸展(ステージ7)の段階で濃縮するには、フルーツジュースプレートを交換し、25°Cで2時間胚を採取し、プレートを取り外し、25°Cでさらに2時間エージングして、2~4時間齢の胚を取得します。 胚から卵殻のような絨毛膜を取り除くには、果汁プレートの表面を50%漂白剤で覆い(表1)、小さな絵筆で胚を寒天の表面から放出し、絨毛膜が溶解するまで3分間待ちます。 脱穂した胚を、4 mLのヘプタン(有機上相)と4 mLの固定バッファー(水性底相; 表1)。新たに調製したストックまたは最近開封したストックからホルムアルデヒドを新たに希釈し、胚を添加する直前に10x PBSおよび脱イオン水と混合します。注:パラホルムアルデヒドパワーまたは16%EMグレードのホルムアルデヒドからガラスアンプルでホルムアルデヒドを調製します。濃縮ホルムアルデヒド(例:37%ホルムアルデヒド)のストックを使用できますが、結果の一貫性が損なわれる可能性があります。 胚は有機相と水相の間の界面に蓄積します。界面に単一の層を形成するように胚をいくつも追加します。バイアルに添加される胚が多すぎると、同様に固定されません。 強力なテープを使用して、卓上シェーカーでシンチレーションバイアルを横向きに固定し、220rpmで20分間攪拌します。最適な固定のために、固定全体を通して有機相と水相の間で活発なエマルジョンを維持します。 固定時間中は、各サンプルについて以下のいずれかを調製してください。3%寒天を半分に充填したプラスチック製の6cmのシャーレベースを取り、かみそりの刃またはメスで寒天に~5cmx3cmの長方形に切り込みを入れます。フルーツジュース/寒天プレートもこの目的に使用できます。 小さなラボスパチュラを使用して、寒天スラブを取り除きます。シャーレの底をひっくり返し、ベンチに置きます。逆さにした皿の上に寒天スラブを置きます(図2A)。 ペトリ皿の蓋を取り、乾いていることを確認します。手袋を着用し、蓋の内側に両面テープを貼ります(テープは寒天スラブより少し大きくする必要があります。 図2B)。 バイアルをシェーカーから取り出し、ベンチに直立させ、有機相と水相を分離します。適切に固定された胚は、2つのフェーズ間の界面に残ります。 固定胚を寒天スラブに移し、ラテックス球根を取り付けたガラス製のパスツールピペットを使用します。胚がピペットの内側に付着するのを防ぐために、胚をピペットの狭い首の中に保ち、一度にすべてではなく、複数の小さなバッチで胚を移植するようにしてください。すべての胚が寒天スラブ上に配置されたら、P200ピペッターを使用して胚の周囲から残留ヘプタンの大部分を取り除きます。このステップをできるだけ早く(<3分)実行して、形態に悪影響を与える可能性のある固定胚の乾燥を回避します。 ~2cmの高さから、両面テープで蓋を寒天スラブに落とし、胚をテープに接着します(図2C)。寒天スラブから蓋をそっと取り外し、ベンチに逆さまに置き、蓋の胚を覆うのに十分なPBS-Tween(表1)を追加します。 約100倍の倍率で間接照明を当てた実体解剖顕微鏡を用いて、形態マーカーを用いて適切に病期分類された胚を同定する。ステージ6の胚には、目に見える頭側溝や陥入中胚葉などのマーカーを使用します。ステージ7の胚には、拡張された生殖バンドのようなマーカーを使用します。ステージ11の胚には、完全に拡張された生殖バンドや頭から尾への軸に沿った目に見えるセグメンテーションなどのマーカーを使用します16。目的の胚を採取するには、まず胚の前端または後端近くのビテリン膜(胚の周りの透明な楕円形の膜)を細いガラス針で刺します。圧力が解放されると、メンブレンは少し収縮します。次に、細かい鉗子または金属プローブを使用して、もう一方の端の胚を穴からそっと押し込みます。Vitellineメンブレンは両面テープに接着されたままになります。望ましくない胚をテープに付着させたままにします。 浮遊するデビテリン化胚をガラス製のパスツールピペットで定期的に回収し、1.5 mLのマイクロチューブに移します。 この時点で、次のいずれかの手順を実行します。免疫蛍光標識ステップに直接進んでください。デビテリン化された胚は、ブロッキング溶液に直接入れることができます(ステップ2.2)。次のステップに進む前に、胚をPBS-Tweenまたはブロッキング溶液(表1)に16時間以上放置しないでください。 胚をメタノールに移して保存します。PBS-Tweenをできるだけ多く除去し、1 mLのメタノールを加えます。胚が落ち着いたら、できるだけ多くのメタノールを取り除き、1 mLの新しいメタノールを加えます。胚は−20°Cで無期限に保管してください。メタノール貯蔵により、複数のコレクションからの胚のプールも可能になります。 2. 免疫蛍光標識 注:抗体のインキュベーションステップを除けば、このセクションでは正確な液体の量と時間は重要ではありません。すすぎまたは洗浄を行うには、胚をチューブの底に沈殿させ、胚を吸い上げずにできるだけ多くの液体を取り除き、~1 mLの新しい液体を追加します。ラテックスバルブを取り付けたガラス製のパスツールピペットを使用して、最適な透明度とコントロールを実現します。すすぎのステップでは、胚は揺り動かされず、落ち着くだけです。洗浄ステップでは、胚を配卵器上で指示された時間揺さぶり、その後沈降させます。 胚をメタノールで保存しなかった場合は、ステップ2.2に進みます。胚をメタノールで保存した場合は、PBS-Tweenで2回すすぎ、PBS-Tweenで20分間2回洗浄します。 1mLのブロッキング溶液で胚を30〜60分間洗浄します。 抗体溶液(表1)で希釈した一次抗体とともに胚を室温で2時間、できれば4°Cで一晩インキュベートします。 このステップは、一次抗体を保存するために、できるだけ少量(50〜300μL)で行ってください。Nutatorの揺動は厳密には必須ではありません。ExMでは、一般的な免疫蛍光実験で使用する一次抗体の量を少なくとも50%増やします。一次抗体濃度は、抗Par-3モルモットポリクローナル21 では1:200、抗GFPウサギポリクローナルでは1:100です。 一次抗体溶液を除去し(必要に応じて4°Cで保存)、PBS-Tweenで2回すすぎ、PBS-Tweenで15分間4回洗浄します。 胚を蛍光二次抗体と最終容量300 μL(抗体溶液で希釈)で、吸育剤上で室温で1時間インキュベートします。蛍光標識されたストレプトアビジンは、このステップ中に添加することができます。このステップ以降は、チューブを不透明な箱の蓋で覆ったり、サンプルを引き出しに保管したりするなどして、可能であれば過度で長時間の光曝露から胚を保護します。以下の濃度を使用してください:Alexa Fluor 488に融合した抗ウサギIgGヤギポリクローナルの場合は1:500。Alexa Fluor 568に融合した抗モルモットIgGヤギポリクローナルは1:500。streptavidin-Alexa Fluor 488 では 1:1000 です。 二次抗体溶液を取り出し、廃棄します。PBS-Tweenで胚を2回すすぎ、PBS-Tweenで15分間4回洗浄します。 この時点で、胚は暗所で4°Cで保存できますが、サンプルはできるだけ早く(<24時間)処理できます。 3. PDMSウェルの準備 注:PDMSウェルは、最大2週間前に作成できます。 インキュベーターまたはホットプレートを55°Cに設定し、円錐形のチューブを回転できる遠心分離機を15°Cに設定します。 PDMS溶液(表1)を調製するには、50 mLのコニカルチューブをスケールの二次容器に入れ、シリンジを使用してチューブに10 gのシリコーンエラストマーベースを添加します。次に、シリコーンエラストマー硬化剤1gを加え、チューブを数回反転させて混合します。 2本目の50 mLコニカルチューブに適量の水を加えてバランスチューブを作成します。PDMS溶液を500 x g で15°Cで3分間遠心分離し、10cmのシャーレに~1mmの深さまで注ぎます。必要に応じて、エアホースで溶液に軽く息を吹きかけて気泡を取り除きます。PDMS溶液を55°Cで一晩固化させます。 PDMSスラブが固まったら、メスを使用して、22 mm x 22 mmのカバーガラスよりもわずかに小さい正方形の領域にスコアを付けます。各正方形の内側に、~8mm幅の正方形のウェルに切り込みを入れて取り除きます。 各正方形のPDMSを22 mm x 22 mmのカバーガラスによく移し、しっかりと接着します(図2D)。6枚以上のカバーガラスを準備すると、画像化できる拡張胚が多数得られるはずです。 4.カバーガラスに胚を接着する 各ウェル内のカバーガラス表面を覆うのに十分な量の0.1%ポリ-L-リジン(~50 μL)を塗布し、55°Cのインキュベーターに入れて自然乾燥します。この手順を繰り返して、接着性を高めます。 1x PBSで胚を1回簡単にすすぎ、Tween界面活性剤を除去し、>10個の胚をポリ-L-リジンでコーティングされた各ウェルに移します。 胚が井戸の底に落ち着くのを待ちます。付着した胚からパスツールピペットを使用して余分な液体を取り除きます。すぐに次のステップに進みます。 5.活性化とゲル化 注:活性化とは、胚にMA-NHSを添加することを指し、サンプルタンパク質と抗体を修飾してハイドロゲルに結合できるようにします。ゲル化とは、各ウェルの胚内およびその周辺にヒドロゲルを生成することを指します。ゲル化中、胚はモノマー溶液で浸透され、次いでゲル化溶液で処理されてヒドロゲルを形成します。 ウェルに活性化溶液(1x PBSで新たに希釈した1 mM MA-NHS; 表1)。この溶液を約10分ごとに1時間にわたって交換します。 胚を1x PBSで3回すすぎます。胚をモノマー溶液(表1)中で4°Cで45分間インキュベートします。 胚がモノマー溶液中にある間に、ゲル化溶液を調製します(表1)。~2 mLのゲル化溶液を調製するだけで、10 cmのシャーレ全体からPDMSウェルを覆うのに十分です。APSは重合を開始してゲル化を開始するため、必ず最後に追加してください。触媒酸化剤を粉末から新たに希釈します(例:1% TEMPO w/vを水に溶かします)。1,960 μL のモノマー溶液を 30 μL の 10% TEMED および 10 μL の 1% TEMPO と組み合わせます。 ゲル化溶液のバッチ全体を一度に重合させないように、小さなバッチで作業してください。ゲル化溶液(APSなし)を125 μLのアリコートに分割し、PCRストリップの8本のチューブに挟みます。 胚を破壊しないように注意しながら、真空を使用して3つのPDMSウェルからモノマー溶液を除去します。ゲル化溶液を入れたPCRチューブの1つにAPSを5 μL添加し、重合を開始します。重合ゲル化溶液をウェル(ウェルあたり~40 μL)に素早く分配します。すべてのウェルと胚が覆われるまでこれを繰り返します。 サンプルを37°Cで1.5〜2.5時間ゲル化させます。 ハイドロゲルを頻繁に攪拌して、重合を監視します。凝固したハイドロゲルは小刻みに揺れません。厚いハイドロゲルは、重合が完了して固化するのに時間がかかります。 6.消化と膨張 注意: ゲルが厚くて大きいほど、膨張に時間がかかり、ゲルの中心が完全に膨張するまでに数時間かかる場合があります。これは、ゲルの端をトリミングすることでスピードアップできます。ゲルが膨張すると、屈折率は水とほぼ同じになり、非常に見づらくなります。 ゲル化が完了したら、ハイドロゲルを乱さないようにしながら、PDMSウェルをカバーガラスから剥がします。必要に応じて、余分なハイドロゲル材料を切り取ります。 ハイドロゲル(カバーガラスに付着したまま)を6ウェルプレートのウェルに個別に移します(図2E)。ヒドロゲルは消化中にわずかに膨張する可能性があることに注意してください。 ゲルを消化バッファー(表1)で37°Cで1時間完全に覆います。 一般に、30 mL の消化バッファーは、6 ウェルプレートでゲルを覆うのに十分です。 消化後、各ハイドロゲルをカバーガラスからスライドさせて6cmのシャーレに個別に移します。ゲルを剥がすために、2枚目のカバーガラスを使用する必要があるかもしれません。各ペトリ皿に脱イオン水を入れてゲルを膨張させます。ゲルが完全に膨張するまで、1〜2時間の間に水を3〜4回交換します(幅が約4倍に増加すると予想されます)。 7. 実装とイメージング 注:膨張したハイドロゲルは、ほぼ完全に水で構成されているため、ほぼ透明で非常に壊れやすいです。ゲルは、長いカバーガラスを使用して操作し、ゲルを動かしたり拾ったりすることができます。一度に1つまたは2つのゲルのみをマウントしてイメージングすると、ゲルは徐々に水を放出し、カバーガラスの周りを滑り始めます。 パスツールピペットを使用して、ペトリ皿から余分な水分をできるだけ取り除き、取り扱い時にゲルが動き回るのを最小限に抑えます。 胚を底面に置いて、各膨張ゲルを大きなカバーガラス(例:24 mm x 40 mm)に操作してイメージングします。 各カバーガラスをゲルで倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡の対物レンズに取り付けます。低倍率(5倍または10倍)または中倍率(20倍)の空気対物レンズを備えた顕微鏡の落射蛍光または明視野顕微鏡モードを使用して、適切にステージングおよび配向された標本を見つけます。 高解像度で画像化するには、高倍率(60倍、63倍、または100倍)の油浸対物レンズまたは水浸対物レンズに切り替えます。画像化するには、胚の表面が対物レンズの焦点範囲(63倍対物レンズの場合はカバーガラスから<300 μm)内にある必要があります。 顕微鏡のレーザー走査型共焦点モードを使用してサンプルからデータを収集します。良好なダイナミックレンジを有する非飽和画像を収集し、サンプル23に関する可能な限り最大の情報を捕捉するために、画像当たりの適切な画素数を使用するようにする。 図2:手作業による失性化とハイドロゲルの操作 。 (A)寒天/果汁プレートから寒天スラブを切り取ります。(B)6cmのシャーレの蓋の内側に両面テープを貼る。(C)テープで留められた蓋に胚を接着する。(D)22 mm x 22 mmのカバーガラスに正方形のウェルを接着したPDMSスラブ。(E)6ウェルプレート内にPDMSウェルを装着したカバーガラス。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。