Süper Çözünürlüklü Görüntüleme için Tam Montajlı Drosophila Embriyolarını Fiziksel Olarak Büyütmek için Genişleme Mikroskobunun Kullanılması

Bu protokol, Arkansas Üniversitesi (UARK) Drosophila melanogaster gibi omurgasız hayvanlar üzerinde araştırma yönergelerini takip eder ve UARK Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından onaylanmıştır (protokol #20001). 1. Drosophila embriyo fiksasyonu ve devitellinizasyon NOT: Adım 1, embriyoyu çevreleyen şeffaf geçirimsiz bir zar olan vitellin membranının manuel olarak çıkarılması için bir prosedürü (elle soyma) açıklar. Daha da önemlisi, elle soyma, ExM protokolünün başlangıcında uygun şekilde evrelenmiş embriyoların seçilmesine izin verir, böylece ExM protokolünün sonunda kullanılabilir bir oryantasyonda embriyo elde etme olasılığını büyük ölçüde artırır. Bununla birlikte, bu ExM protokolü, toplu embriyo toplama ve vitellin membranının metanol bazlı çıkarılması için standart prosedürlerle tamamen uyumludur, bu durumda doğrudan adım 2’ye (immünofloresan etiketleme) atlanabilir. Birkaç ince cam iğne hazırlayın veya satın alın. İğne ucunun gerçek boyutları kritik değildir, ancak iğnelerin sabit embriyoların vitellin zarlarını delecek kadar sert ve keskin olduğundan emin olun. Embriyo mikroenjeksiyonları için iğneler hazırlarken, bir mikropipet çektirmesi kullanarak cam kılcal tüplerden (1 mm dış çap, 0.75 mm iç çap) iğneler yapın18; Alternatif olarak, önceden çekilmiş iğneler satın alın. Standart Drosophila tekniklerinikullanarak embriyoları toplayın 19 >100 yetişkin Drosophila’yı meyve suyu / agar plakası20 ile kapatılmış havalandırmalı plastik bir kaba yerleştirerek. Uygun aşama16’daki embriyoları zenginleştirmek için zamanlanmış toplama pencerelerini kullanın. Örneğin, gastrulasyon (aşama 6) ve yakınsak ekstansiyon (aşama 7) aşamalarını zenginleştirmek için, meyve suyu plakasını değiştirin, embriyoları 25 ° C’de 2 saat boyunca toplayın, ardından plakayı çıkarın ve ~ 2-4 saat eski embriyolar elde etmek için 25 ° C’de 2 saat daha yaşlandırın. Yumurta kabuğu benzeri koryonu embriyolardan çıkarmak için meyve suyu tabaklarının yüzeyini çamaşır suyu ile kaplayın (Tablo 1), embriyoları küçük bir boya fırçası ile çalkalayarak agar yüzeyinden serbest bırakın ve koryonun çözünmesi için 3 dakika bekleyin. Dekoryonlu embriyoları bir boya fırçası kullanarak 4 mL heptan (organik üst faz) ve 4 mL fiksasyon tamponu (sulu alt faz; Tablo 1). Formaldehiti taze hazırlanmış veya yeni açılmış bir stoktan taze olarak seyreltin ve embriyoları eklemeden hemen önce 10x PBS ve deiyonize su ile karıştırın.NOT: Formaldehiti paraformaldehit gücünden veya cam ampullerde EM dereceli formaldehitten hazırlayın. Konsantre formaldehit stokları (örneğin, formaldehit) kullanılabilir, ancak sonuçlar daha az tutarlı olabilir. Embriyolar, organik ve sulu fazlar arasındaki arayüzde birikecektir. Arayüzde tek bir katman oluşturacak kadar embriyo ekleyin. Bir şişeye çok fazla embriyo eklenirse, bunlar da düzelmez. Güçlü bant kullanarak, parıldama şişelerini yanlarında bir masa üstü çalkalayıcı üzerinde hareketsiz hale getirin ve 220 rpm’de 20 dakika çalkalayın. Optimum fiksasyon için, tüm fiksasyon boyunca organik ve sulu fazlar arasında kuvvetli bir emülsiyon sağlayın. Sabitleme süresi boyunca, numunelerin her biri için aşağıdakilerden birini hazırlayın.Yarısına kadar %3 agar ile doldurulmuş 6 cm’lik plastik bir Petri kabı tabanı alın ve bir tıraş bıçağı veya neşter ile agarda ~5 cm x 3 cm’lik bir dikdörtgen çizin. Meyve suyu/agar tabakları da bu amaçla kullanılabilir. Küçük bir laboratuvar spatulası kullanarak agar levhasını çıkarın. Petri kabının tabanını ters çevirin ve tezgahın üzerine koyun. Agar levhasını ters çevrilmiş tabağın üzerine yerleştirin (Şekil 2A). Petri kabının kapağını alın ve kuru olduğundan emin olun. Eldiven giyerek, kapağın içine bir parça çift taraflı bant yerleştirin (bant parçası agar levhasından biraz daha büyük olmalıdır; Şekil 2B). Şişeleri çalkalayıcıdan çıkarın, tezgahın üzerine dik olarak yerleştirin ve organik ve sulu fazların ayrılmasına izin verin. Düzgün bir şekilde sabitlenmiş embriyolar, iki faz arasındaki arayüzde kalacaktır. Sabitlenmiş embriyoları, lateks ampul takılı bir cam Pasteur pipeti kullanarak agar levhasına aktarın. Embriyoların pipetin içine yapışmasını önlemek için, embriyoları pipetin dar boynunda tutmaya çalışın ve embriyoları bir kerede değil, birden fazla küçük parti halinde transfer edin. Tüm embriyolar agar levhasına girdikten sonra, bir P200 pipetleyici kullanarak embriyoların etrafındaki kalan heptanın çoğunu çıkarın. Morfolojiyi olumsuz etkileyebilecek sabit embriyoların kurumasını önlemek için bu adımı mümkün olduğunca çabuk (<3 dakika) gerçekleştirin. ~2 cm yükseklikten, embriyoları banda yapıştırmak için çift taraflı bantlı kapağı agar levhasının üzerine bırakın (Şekil 2C). Kapağı agar levhasından yavaşça çıkarın, tezgahın üzerine baş aşağı yerleştirin ve ardından kapaktaki embriyoları kaplayacak kadar PBS-Tween (Tablo 1) ekleyin. Dolaylı aydınlatma ile yaklaşık 100x büyütmede bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanarak, morfolojik belirteçler kullanarak uygun şekilde evrelenmiş embriyoları tanımlayın. Evre 6 embriyolar için, görünür bir sefalik karık ve istila edilmiş mezoderm gibi belirteçler kullanın; Evre 7 embriyoları için, genişletilmiş bir germ bandı gibi belirteçler kullanın; Evre 11 embriyoları için, tamamen uzatılmış bir germband ve baştan kuyruğa eksen16 boyunca görünür segmentasyon gibi belirteçler kullanın.İstenilen embriyoları toplamak için, önce embriyonun ön veya arka ucuna yakın vitellin zarını (embriyonun etrafındaki şeffaf oval bir zar) ince bir cam iğne ile delin; Basınç serbest kaldıkça membran biraz sönecektir. Daha sonra, ince forseps veya metal bir prob kullanarak, diğer ucundaki embriyoyu delikten yavaşça itin; Vitellin membranı çift taraflı banda yapışık kalacaktır. İstenmeyen embriyoları banda yapıştırılmış halde bırakın. Yüzen devitellinize embriyoları periyodik olarak bir cam Pasteur pipeti ile toplayın ve bunları 1.5 mL’lik bir mikrofüj tüpüne taşıyın. Bu noktada, aşağıdaki adımlardan birini gerçekleştirin.Doğrudan immünofloresan etiketleme adımlarına devam edin. Devitellinize embriyolar doğrudan bloke edici çözeltiye gidebilir (adım 2.2). Bir sonraki adıma geçmeden önce embriyoların PBS-Tween veya bloke edici solüsyonda (Tablo 1) 16 saatten daha uzun süre kalmasına izin vermeyin. Embriyoları saklamak için metanole taşıyın. PBS-Tween’i mümkün olduğunca çıkarın ve ardından 1 mL metanol ekleyin. Embriyolar yerleştikten sonra, mümkün olduğunca fazla metanol çıkarın ve 1 mL taze metanol ekleyin. Embriyoları −20 °C’de süresiz olarak saklayın. Metanol depolaması ayrıca birden fazla koleksiyondan embriyoların bir araya getirilmesine izin verir. 2. İmmünofloresan etiketleme NOT: Antikor inkübasyon adımlarının yanı sıra, kesin sıvı miktarları ve süreleri bu bölümde kritik değildir. Durulama veya yıkama yapmak için, embriyoların tüpün dibine çökmesine izin verin, embriyoları emmeden mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın ve ardından ~ 1 mL yeni sıvı ekleyin; optimum netlik ve kontrol için lateks ampul ile donatılmış bir cam Pasteur pipeti kullanın. Durulama aşaması için embriyolar sallanmaz, sadece yerleşmesine izin verilir; Yıkama aşaması için, embriyolar belirtilen süre boyunca bir nutatör üzerinde sallanır ve daha sonra yerleşmesine izin verilir. Embriyolar metanolde saklanmadıysa, adım 2.2’ye geçin. Embriyolar metanolde saklandıysa, PBS-Tween ile iki kez durulayın ve ardından PBS-Tween ile iki kez 20 dakika yıkayın. Embriyoları 1 mL bloke edici solüsyonda 30-60 dakika yıkayın. Embriyoları antikor çözeltisi (Tablo 1) içinde seyreltilmiş primer antikorlarla oda sıcaklığında 2 saat veya tercihen gece boyunca 4 °C’de inkübe edin. Primer antikorları korumak için bu adımı mümkün olduğunca küçük bir hacimde (50-300 μL) gerçekleştirin; Bir nutatör üzerinde sallanmak kesinlikle gerekli değildir.Tipik bir immünofloresan deneyinde kullanılan primer antikor miktarını ExM için en az artırın. Aşağıdaki birincil antikor konsantrasyonlarını kullanın: Anti-Par-3 kobay poliklonal21 için 1:200 ve anti-GFP tavşan poliklonal için 1:100. Birincil antikor solüsyonunu çıkarın (istenirse 4 °C’de tasarruf edin), PBS-Tween ile iki kez durulayın ve ardından PBS-Tween ile dört kez 15 dakika yıkayın. Embriyoları, bir nutatör üzerinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca 300 μL’lik (antikor çözeltisi içinde seyreltilmiş) bir son hacimde floresan sekonder antikorlarla inkübe edin. Bu adımda floresan etiketli streptavidin eklenebilir. Bu adımdan itibaren, embriyoları mümkün olduğunda aşırı ve uzun süreli ışığa maruz kalmaktan koruyun, örneğin tüpleri opak bir kutu kapağıyla kapatarak veya örnekleri bir çekmecede tutarak.Aşağıdaki konsantrasyonları kullanın: Alexa Fluor 488 ile kaynaşmış anti-tavşan IgG keçi poliklonal için 1:500; Alexa Fluor 568 ile kaynaşmış anti-kobay IgG keçi poliklonal için 1:500; ve streptavidin-Alexa Fluor 488 için 1:1000. İkincil antikor çözeltisini çıkarın ve atın. Embriyoları PBS-Tween ile iki kez durulayın ve PBS-Tween ile dört kez 15 dakika yıkayın. Bu noktada, embriyolar karanlıkta 4 ° C’de saklanabilir, ancak örnekleri mümkün olduğunca çabuk (<24 saat) işleyebilir. 3. PDMS kuyularının hazırlanması NOT: PDMS kuyuları 2 hafta öncesine kadar yapılabilir. Bir inkübatörü veya sıcak plakayı 55 °C’ye ayarlayın ve konik boruları 15 °C’ye döndürebilen bir santrifüj ayarlayın. PDMS çözeltisini hazırlamak için (Tablo 1), 50 mL’lik bir konik tüpü bir ölçek üzerinde ikincil bir kaba yerleştirin ve bir şırınga kullanarak tüpe 10 g silikon elastomer baz ekleyin. Ardından, 1 g silikon elastomer kürleme maddesi ekleyin ve karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. İkinci bir 50 mL konik tüpe uygun miktarda su ekleyerek bir denge tüpü oluşturun. PDMS çözeltisini 500 x g’da 15 °C’de 3 dakika santrifüjleyin ve ardından ~1 mm derinliğe kadar 10 cm’lik bir Petri kabına dökün. Gerekirse, bir hava hortumu ile çözeltiye hafifçe üfleyerek kabarcıkları çıkarın. PDMS çözeltisinin gece boyunca 55 °C’de katılaşmasına izin verin. PDMS levhası bir neşter kullanılarak katılaştıktan sonra, 22 mm x 22 mm’lik bir lamelden biraz daha küçük olan kare alanları puanlayın. Her karenin içinde, ~8 mm genişliğinde bir kare kuyusu çizin ve çıkarın. Her kare PDMS’yi 22 mm x 22 mm’lik bir lamel üzerine iyice aktarın ve sıkıca yapıştırın (Şekil 2D). Altı veya daha fazla lamel hazırlamak, görüntü için iyi sayıda genişlemiş embriyo vermelidir. 4. Embriyoların lamellere yapıştırılması Her bir oyuğun (~50 μL) içindeki lamel yüzeyini kaplamaya yetecek kadar% 0.1 poli-L-lizin uygulayın ve havada kuruması için 55 ° C’lik bir inkübatöre yerleştirin. Yapışkanlığı artırmak için bu adımı tekrarlayın. Tween deterjanını çıkarmak için embriyoları 1x PBS’de bir kez kısaca durulayın ve ardından >10 embriyoyu poli-L-lizin kaplı oyukların her birine aktarın. Embriyoların kuyucukların dibine yerleşmesine izin verin. Bir Pasteur pipeti kullanarak yapışan embriyolardan fazla sıvıyı çıkarın. Hemen bir sonraki adıma geçin. 5. Aktivasyon ve jelleşme NOT: Aktivasyon, numune proteinlerini ve antikorları hidrojele bağlanabilmeleri için değiştirecek olan embriyolara MA-NHS’nin eklenmesini ifade eder. Jelleşme, her bir oyuktaki embriyoların içinde ve çevresinde bir hidrojel oluşumunu ifade eder. Jelleşme sırasında, embriyolara bir monomer çözeltisi nüfuz edilir ve daha sonra hidrojeli oluşturmak için bir jelleşme çözeltisi ile muamele edilir. Kuyucukları aktivasyon solüsyonu ile doldurarak embriyoları oda sıcaklığında 1 saat aktive edin (1x PBS’de taze seyreltilmiş 1 mM MA-NHS; Tablo 1). Bu çözümü 1 saat boyunca yaklaşık olarak her 10 dakikada bir değiştirin. Embriyoları 1x PBS ile üç kez durulayın. Embriyoları monomer solüsyonunda (Tablo 1) 4 ° C’de 45 dakika inkübe edin. Embriyolar monomer solüsyonunda otururken jelleşme solüsyonunu hazırlayın (Tablo 1). ~ 2 mL jelasyon çözeltisinin hazırlanması, PDMS kuyucuklarını 10 cm’lik bir Petri kabının tamamından kaplamak için yeterlidir. Polimerizasyonu başlatacağı ve jelleşmeye başlayacağı için APS’yi en son eklediğinizden emin olun.Katalitik oksidanı tozdan taze olarak seyreltin (örn., su içinde %1 TEMPO w/v). 1.960 μL monomer çözeltisini 30 μL TEMED ve 10 μL %1 TEMPO ile birleştirin. Tüm jelleşme çözeltisi partisinin bir kerede polimerize olmasını önlemek için, küçük partiler halinde çalışın. Jelleşme solüsyonunu (APS olmadan) bir PCR şeridinin sekiz tüpü arasında 125 μL’lik alikotlara bölün. Embriyoları bozmamaya dikkat ederken bir vakum kullanarak monomer çözeltisini üç PDMS kuyusundan çıkarın. Polimerizasyonu başlatmak için jelleşme çözeltisi içeren PCR tüplerinden birine 5 μL APS ekleyin. Polimerize jelleşme çözeltisini kuyucuklar arasında hızla dağıtın (kuyucuk başına ~40 μL). Tüm kuyular ve embriyolar kaplanana kadar bunu tekrarlayın. Numunelerin 37 °C’de 1,5-2,5 saat jelleşmesine izin verin. Polimerizasyonu izlemek için hidrojelleri sık sık çalkalayın. Katılaşmış hidrojeller kıpırdamaz. Daha kalın hidrojellerin polimerizasyonu tamamlaması ve katılaşması daha uzun sürecektir. 6. Sindirim ve genişleme NOT: Daha kalın ve daha büyük jellerin genişlemesi daha uzun sürer ve jellerin merkezinin tamamen genişlemesi birkaç saat sürebilir; Bu, jelin kenarları kesilerek hızlandırılabilir. Jeller genişledikçe, kırılma indisleri suyunkiyle neredeyse aynı olacak ve görülmeleri çok zor hale gelecektir. Jelleşme tamamlandıktan sonra, hidrojelleri rahatsız etmemeye çalışırken PDMS kuyucuklarını lamelden soyun. İsterseniz fazla hidrojel malzemeyi kesin. Hidrojelleri (hala lamellere bağlı) ayrı ayrı altı oyuklu bir plakanın kuyularına aktarın (Şekil 2E). Hidrojellerin sindirim sırasında hafifçe genişleyebileceğini unutmayın. Jelleri 37 °C’de 1 saat boyunca sindirim tamponu (Tablo 1) ile tamamen kapatın. Genel olarak, jelleri 6 oyuklu bir plakada kaplamak için 30 mL sindirim tamponu yeterlidir. Sindirimden sonra, her bir hidrojeli ayrı ayrı lamelden kaydırarak 6 cm’lik bir Petri kabına aktarın. Jeli yerinden çıkarmak için ikinci bir lamel kullanmak gerekebilir. Jeli genişletmek için her Petri kabını deiyonize suyla doldurun. Jeller tamamen genleşene kadar suyu 1-2 saat boyunca üç ila dört kez değiştirin (genişlikte yaklaşık dört kat artış bekleyin). 7. Montaj ve görüntüleme NOT: Genleşmiş hidrojeller neredeyse tamamen sudan oluşur, bu da onları neredeyse şeffaf ve son derece kırılgan hale getirir. Jeller, onları hareket ettirmek ve almak için uzun lameller kullanılarak manipüle edilebilir. Bir seferde yalnızca bir veya iki jeli monte edin ve görüntüleyin, çünkü jeller yavaş yavaş suyu serbest bırakacak ve lamel etrafında kaymaya başlayacaktır. Bir Pasteur pipeti kullanarak, kullanıldığında hareket eden jelleri en aza indirmek için Petri kabından mümkün olduğunca fazla suyu alın. Her genişletilmiş jeli, alt yüzeydeki embriyolarla birlikte, görüntüleme için büyük bir lamel (örneğin, 24 mm x 40 mm) üzerine manevra yapın. Her bir lamel jel ile ters çevrilmiş bir lazer taramalı konfokal mikroskobun objektifi üzerine monte edin. Düşük büyütmeli (5x veya 10x) veya orta büyütmeli (20x) hava hedefli mikroskopta epifloresan veya parlak alan mikroskobu modlarını kullanarak uygun şekilde hazırlanmış ve yönlendirilmiş numuneleri bulun. Yüksek çözünürlükte görüntü almak için yüksek büyütmeli (60x, 63x veya 100x) yağa veya suya daldırma objektifine geçin. Embriyoların yüzeyi, görüntülenebilmesi için objektifin odaklama aralığı içinde olmalıdır (63x objektif için lamelden <300 μm). Mikroskopta lazer taramalı konfokal modu kullanarak numunelerden veri toplayın. İyi dinamik aralığa sahip doygun olmayan görüntüleri topladığınızdan emin olun ve örnek23 hakkında mümkün olan en yüksek bilgiyi yakalamak için görüntü başına uygun sayıda piksel kullanın. Şekil 2: Manuel devitellinizasyon ve hidrojellerle çalışma . (A) Bir agar/meyve suyu tabağından bir agar levhasının kesilmesi. (B) 6 cm’lik bir Petri kabının kapağının içine çift taraflı bant yerleştirmek. (C) Embriyoların bantlanmış kapağa yapıştırılması. (D) 22 mm x 22 mm’lik bir lamel üzerine iyi yapıştırılmış kare bir PDMS levhası. (E) 6 oyuklu bir plakanın içinde bir PDMS kuyusu bulunan lamel Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.