Ein löslicher Tetrazolium-basierter Reduktionstest zur Bewertung der Wirkung von Antikörpern auf Candida tropicalis-Biofilme

Die systemische Candidiasis ist die vierte Hauptursache für nosokomiale Infektionen, die weltweit mit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten einhergehen. Weltweit betrifft die systemische Candidiasis etwa 700.000 Personen¹. Candida-Arten, nämlich C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata und C. auris, sind die häufigste Ursache für invasive Candida-Infektionen ². Candida-Arten sind opportunistische Krankheitserreger, die Biofilme produzieren³. Biofilme sind überwiegend mit Candida-Virulenz assoziiert, und Candida kann oxidativen und osmotischen Stressbedingungen standhalten, indem es die Biofilmbildung induziert⁴. Biofilme modulieren die Expression von Virulenzfaktoren und Zellwandkomponenten weiter und bilden eine exopolymere Schutzmatrix, die Candida hilft, sich an verschiedene Wirtsnischen anzupassen⁴. Biofilme tragen zur Hefehaftung auf Wirtsgewebe und medizinischen Instrumenten bei⁵. Daher ist die Biofilmbildung mit einem Vorteil für Hefen verbunden, da Hefezellen innerhalb der Biofilme der Immunantwort des Wirts ausweichen können⁶. Die Biofilmbildung schützt auch die pathogenen Hefen vor der Wirkung von Antimykotika⁵. Eine verminderte Empfindlichkeit von C. albicans-Biofilmen gegenüber Amphotericin B wurde von Pierce et ^al.7,8 nachgewiesen. Darüber hinaus zeigen Biofilme eine antimykotische Arzneimittelresistenz gegen Fluconazol, was die effektive Behandlung der systemischen Candidiasis beeinträchtigt ^9,10.

Mikroben haben eine intrinsische Tendenz, an verschiedenen biotischen und abiotischen Oberflächen zu haften, was zur Biofilmbildung führt. Candida albicans, ein dimorpher Pilz, existiert in Hefe- und Hyphenformen, und seine Biofilmbildung wurde in verschiedenen in vitro und in vivo Modellsystemen charakterisiert¹¹. Die Schritte der Biofilmbildung umfassen die Adhäsion von Candida-Zellen am Substrat, die Filamentierung, die Proliferation und die Biofilmreifung¹¹. Zunächst haftet die Hefeform von C. albicans an Substraten, einschließlich medizinischer Geräte und menschlichem Gewebe, gefolgt von der Filamentierung und Proliferation von C. albicans in Hyphen- und Pseudohyphalformen und schließlich der Reifung von Biofilmen, die in die extrazelluläre Matrix¹¹ eingebettet sind. Die Biofilmbildung trägt wesentlich zu den Pathogenesemechanismen von C. albicans bei¹². Candida-Arten bilden arzneimittelresistente Biofilme, was ihre Ausrottung schwierig macht¹³. Eine kleine Untergruppe der C. albicans-Biofilm-produzierenden Population wurde als sehr resistent gegen die Antimykotika Amphotericin B und Chlorhexidin¹⁴ beschrieben. Bemerkenswert ist, dass Hefezellen in Biofilmen im Vergleich zu Hefezellen in der Planktonphase und Proliferationsphase¹⁴ eine hohe Resistenz gegen Multidrug-Therapie aufweisen. Es wurde vorgeschlagen, dass Hefezellen, die in Biofilmen vorhanden sind, sehr tolerant gegenüber Antimykotika sind, was zum Überleben von C. albicans in Biofilmen beiträgt¹⁴. Es wurde berichtet, dass diese vorhandenen Zellen phänotypische Varianten von C. albicans und keine Mutanten sind¹⁴. Darüber hinaus sind Zellen von Candida-Biofilmen, die als “Persister-Zellen” bekannt sind, tolerant gegenüber hohen Dosen der Amphotericin-B-Behandlung und tragen zum Überleben von Candida bei, wodurch eine große Belastung durch wiederkehrende systemische Candida-Infektionen bei Hochrisikopersonen darstellt¹⁵.

Die Zunahme der antimykotischen Arzneimittelresistenz bei Candida-Stämmen erfordert die Erforschung neuer Antimykotika und Immuntherapien. Wie aus den oben genannten Studien hervorgeht, zeigen Candida-Biofilme eine verminderte Anfälligkeit für Antimykotika. Daher besteht ein Bedarf an verbesserten Immuntherapien, um die Bildung von Candida-Biofilmen zu kontrollieren. Frühere Studien haben gezeigt, dass CAGTA einen wirksamen Schutz vor systemischen Candida-Infektionen bieten kann, indem es die Biofilmbildung von C. albicans in vitro^{hemmt 16}. Eine andere Studie berichtete, dass die Immunisierung von Mäusen mit C. albicans rAls3-N-Protein hohe Antikörpertiter induziert, die die Biofilmbildung von C. albicans in vitro¹⁷ stören. Anti-Als3-N-Antikörper übten auch eine hemmende Wirkung auf die Ausbreitung von C. albicans aus Biofilmen^{aus 17}. Der NDV-3A-Impfstoff auf Basis von C. albicans befindet sich derzeit in der klinischen Prüfung und es wurde auch festgestellt, dass Anti-NDV-3A-Seren die Biofilmbildung von C. auris reduzieren¹⁸. Eine kürzlich durchgeführte Studie identifizierte die Hemmung der Biofilmbildung durch Sap2-Antikörper als Schutzmechanismus in einem murinen Modell der systemischen Candidiasis¹⁹.

Dieser Artikel skizziert ein detailliertes In-vitro-Protokoll zur Bewertung der Wirkung von antigenspezifischen Antikörpern, die in polyklonalem Serum aus verschiedenen Gruppen von Sap2-geimpften Mäusen auf vorgeformten Candida tropicalis-Biofilmen vorhanden sind. Um dies zu erreichen, wurde eine auf einem XTT-Reduktionsassay basierende Methode optimiert und im Labor entwickelt, die die Biofilmlebensfähigkeit schnell, empfindlich und mit hohem Durchsatz in Gegenwart oder Abwesenheit von Antikörpern messen kann.

Der XTT-Assay wird verwendet, um die zelluläre Stoffwechselaktivität als Indikator für Zelllebensfähigkeit, Zellproliferation und Zytotoxizität zu messen²⁰. Dieser kolorimetrische Assay basiert auf der Reduktion eines gelben Tetrazoliumsalzes, Natrium 3′-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro) benzolsulfonsäurehydrat (XTT) zu einem orangefarbenen Formazanfarbstoff durch metabolisch aktive Zellen. Da nur lebensfähige Zellen XTT reduzieren können, ist die Menge an reduziertem XTT-Formazan proportional zur Intensität der Farbe und Zelllebensfähigkeit. Der gebildete Formazan-Farbstoff ist wasserlöslich und wird direkt mit einem Plattenleser quantifiziert. Aufgrund seiner wasserlöslichen Natur ermöglicht der XTT-Assay die Untersuchung intakter Biofilme sowie die Untersuchung der Empfindlichkeit von Biofilmarzneimitteln ohne Störung der Biofilmstruktur²¹. Darüber hinaus wird diese Methode aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit, Geschwindigkeit, Genauigkeit, ihres hohen Durchsatzes und ihres hohen Reproduzierbarkeitsgrades in Candida-Pilzlebensfähigkeitsbewertungen implementiert ^7,22.

Neben dem XTT-Reduktionstest wurden auch zahlreiche alternative Techniken zur Messung der Biofilmmenge identifiziert. Einige davon umfassen die Verwendung des MTT-Reduktionsassays, die Kristallviolettfärbung, die DNA-Quantifizierung, die quantitative PCR, die Proteinquantifizierung, die Messung des Trockenzellgewichts und die Zählung lebensfähiger Kolonien. Diese Verfahren unterscheiden sich stark in Bezug auf ihren Zeit- und Kostenaufwand. Taff et al. führten eine vergleichende Analyse von sieben verschiedenen Candida-Biofilm-Quantifizierungsassays durch und stellten fest, dass der XTT-Assay die reproduzierbarste, genaueste und effizienteste Methode für die quantitative Schätzung von C. albicans-Biofilmen darstellte²³. Färbetechniken wie Kristallviolett haben bestimmte Einschränkungen; Der Kristallvioletttest bestimmt indirekt die Menge an Biofilm, indem er die optische Dichte der kristallviolett gefärbten Biofilmmatrix und -zellen misst. Obwohl der kristallviolette Assay ein gutes Maß für die Biofilmmasse liefert, gibt er kein Maß für die Biofilmlebensfähigkeit, da er sowohl mikrobielle Zellen als auch die extrazelluläre Matrix färbt²⁴. Dhale et al. berichteten weiter, dass der XTT-Reduktionstest die empfindlichste, reproduzierbarste, genaueste, effizienteste und spezifischste Methode zum Nachweis der Biofilmproduktion im Vergleich zum kristallvioletten Assay²⁵ war. Literaturberichte haben gezeigt, dass der XTT-Assay gut mit dem CFU/mL-Parameter in der CFU-Zählmethode korreliert. Im Vergleich zum XTT-Assay ist die CFU-Methode jedoch arbeitsintensiv und langsam²⁶. Darüber hinaus ist der Anteil abgelöster lebender Zellen möglicherweise nicht repräsentativ für die ursprüngliche Biofilmpopulation²⁷. Obwohl der XTT-Reduktionstest die beste verfügbare Option zur Quantifizierung der Lebensfähigkeit zu sein scheint, gibt es einige Einschränkungen dieser Technik. Während die XTT-Methode für Vergleiche mit einem Pilzstamm nützlich ist, kann ihre Verwendung beim Vergleich verschiedener Pilzstämme und -arten begrenzt sein. Vergleiche zwischen Stämmen können ohne detaillierte Standardisierung schwierig sein, da verschiedene Stämme Substrate mit unterschiedlichen Fähigkeiten metabolisieren²¹.