Um ensaio de redução solúvel à base de tetrazólio para avaliar o efeito de anticorpos em biofilmes de Candida tropicalis

A candidíase sistêmica é a quarta principal causa de infecções nosocomiais, que estão associadas a altas taxas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Globalmente, a candidíase sistêmica afeta aproximadamente 700.000 indivíduos¹. Espécies de Candida, a saber, C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata e C. auris, são a causa mais comum de infecções invasivas por Candida ². As espécies de Candida são patógenos oportunistas que produzem biofilmes³. Os biofilmes estão predominantemente associados à virulência de Candida, e a Candida pode suportar condições de estresse oxidativo e osmótico induzindo a formação de biofilme⁴. Os biofilmes modulam ainda mais a expressão de fatores de virulência e componentes da parede celular e formam uma matriz protetora exopolimérica, ajudando a Candida a se adaptar a diferentes nichos de hospedeiros⁴. Os biofilmes contribuem para a aderência da levedura nos tecidos do hospedeiro e instrumentos médicos⁵. Como tal, a formação de biofilme está associada a uma vantagem para as leveduras, uma vez que as células de levedura dentro dos biofilmes podem evadir a resposta imune do hospedeiro⁶. A formação de biofilme também protege as leveduras patogênicas da ação de drogas antifúngicas⁵. A diminuição da suscetibilidade dos biofilmes de C. albicans à anfotericina B foi demonstrada por Pierce et ^al.7,8. Além disso, os biofilmes demonstram resistência a medicamentos antifúngicos ao fluconazol, o que prejudica o manejo efetivo da candidíase sistêmica ^9,10.

Os micróbios têm uma tendência intrínseca a aderir a várias superfícies bióticas e abióticas, o que resulta na formação de biofilme. Candida albicans, que é um fungo dimórfico, existe nas formas levedura e hifal, e sua formação de biofilme tem sido caracterizada em vários sistemas modelo in vitro e in vivo ¹¹. As etapas da formação do biofilme incluem a adesão das células de Candida ao substrato, a filamentação, a proliferação e a maturação do biofilme¹¹. Inicialmente, a forma de levedura de C. albicans adere a substratos, incluindo dispositivos médicos e tecido humano, seguida de filamentação e proliferação de C. albicans em formas hifais e pseudo-hifais e, finalmente, maturação de biofilmes embutidos na matriz extracelular¹¹. A formação de biofilme contribui em grande parte para os mecanismos de patogênese de C. albicans ¹². As espécies de Candida formam biofilmes resistentes a medicamentos, o que torna sua erradicação desafiadora¹³. Um pequeno subconjunto da população produtora de biofilme de C. albicans tem sido descrito como altamente resistente aos antifúngicos anfotericina B e clorexidina¹⁴. Vale ressaltar que as células de levedura em biofilmes apresentam alta resistência à poliquimioterapia em comparação com as células de levedura na fase planctônica e na fase de proliferação¹⁴. Tem sido sugerido que as células de levedura existentes em biofilmes são altamente tolerantes a drogas antifúngicas, o que contribui para a sobrevivência de C. albicans em biofilmes¹⁴. Essas células existentes foram relatadas como variantes fenotípicas de C. albicans e não mutantes¹⁴. Além disso, células de biofilmes de Candida conhecidas como “células persistentes” são tolerantes a altas doses de tratamento com anfotericina B e contribuem para a sobrevivência de Candida, representando assim uma grande carga de infecções sistêmicas recorrentes por Candida em indivíduos de alto risco¹⁵.

O aumento da resistência a medicamentos antifúngicos em cepas de Candida requer pesquisa para novos agentes antifúngicos e imunoterapias. Como evidenciado a partir dos estudos acima mencionados, os biofilmes de Candida mostram diminuição da suscetibilidade a drogas antifúngicas. Portanto, há uma necessidade de imunoterapias melhoradas para controlar a formação de biofilme de Candida. Estudos anteriores mostraram que a CAGTA pode fornecer proteção eficaz contra infecções sistêmicas por Candida, inibindo a formação de biofilme de C. albicans in vitro¹⁶. Outro estudo relatou que a imunização de camundongos com a proteína rAls3-N de C. albicans induz altos títulos de anticorpos que interferem na formação de biofilme de C. albicans in vitro ¹⁷. Os anticorpos anti-Als3-N também exerceram efeito inibitório sobre a dispersão de C. albicans a partir de biofilmes¹⁷. A vacina NDV-3A à base de C. albicans está atualmente em fase de ensaio clínico e os soros anti-NDV-3A também reduziram a formação de biofilme de C. auris ¹⁸. Um estudo recente identificou a inibição da formação de biofilme por anticorpos Sap2 como mecanismo de proteção em um modelo murino de candidíase sistêmica¹⁹.

Este trabalho descreve um protocolo in vitro detalhado para avaliar o efeito de anticorpos antígeno-específicos presentes no soro policlonal obtidos de diferentes grupos de camundongos vacinados com Sap2 em biofilmes pré-formados de Candida tropicalis . Para isso, um método baseado em um ensaio de redução de XTT foi otimizado e desenvolvido em laboratório, que pode medir a viabilidade do biofilme de forma rápida, sensível e de alto rendimento, na presença ou ausência de anticorpos.

O ensaio XTT é utilizado para medir a atividade metabólica celular como indicador de viabilidade celular, proliferação celular e citotoxicidade²⁰. Este ensaio colorimétrico baseia-se na redução de um sal de tetrazólio amarelo, sódio 3′-[1-(fenilaminocarbonil)-3,4-tetrazólio]-bis (4-metoxi-6-nitro) benzeno sulfônico hidratado (XTT) para um corante formazan laranja por células metabolicamente ativas. Como apenas células viáveis podem reduzir o XTT, a quantidade de XTT formazan reduzido é proporcional à intensidade da cor e à viabilidade celular. O corante formazan formado é solúvel em água e é diretamente quantificado usando um leitor de placas. Devido à sua natureza solúvel em água, o ensaio XTT permite o estudo de biofilmes intactos, bem como o exame da suscetibilidade a fármacos bioplápticos, sem interrupção da estrutura do biofilme²¹. Além disso, esse método é implementado nas avaliações de viabilidade fúngica de Candida devido à sua facilidade de uso, velocidade, precisão, alto rendimento e alto grau de reprodutibilidade ^7,22.

Além do ensaio de redução de XTT, inúmeras técnicas alternativas também foram identificadas para a medição da quantidade de biofilme. Alguns deles incluem o uso do ensaio de redução de MTT, coloração violeta cristalina, quantificação de DNA, PCR quantitativa, quantificação de proteínas, medição do peso das células secas e contagem viável de colônias. Esses procedimentos variam muito em termos de seus requisitos de tempo e custo. Taff et al. realizaram uma análise comparativa de sete diferentes ensaios de quantificação de biofilme de Candida e descobriram que o ensaio de XTT forneceu o método mais reprodutível, preciso e eficiente para a estimativa quantitativa de biofilmes de C. albicans ²³. Técnicas de coloração como o violeta cristal têm certas limitações; o teste de violeta cristal determina indiretamente a quantidade de biofilme medindo a densidade óptica da matriz e das células de biofilme coradas com violeta cristal. Embora o ensaio de violeta cristal forneça uma boa medida de massa de biofilme, ele não fornece uma medida de viabilidade do biofilme, pois cora tanto as células microbianas quanto a matriz extracelular²⁴. Dhale et al. relataram ainda que o ensaio de redução de XTT foi o método mais sensível, reprodutível, preciso, eficiente e específico para detectar a produção de biofilme em comparação com o ensaio violeta cristal²⁵. Relatos da literatura têm mostrado que o ensaio de XTT se correlaciona bem com o parâmetro UFC/mL no método de contagem de UFC. No entanto, em comparação com o ensaio XTT, o método CFU é trabalhoso e lento²⁶. Além disso, a fração de células vivas destacadas pode não ser representativa da população inicial de biofilme²⁷. Embora o ensaio de redução de XTT pareça a melhor opção disponível para quantificar a viabilidade, existem algumas limitações dessa técnica. Embora o método XTT seja útil para comparações envolvendo uma cepa fúngica, seu uso pode ser limitado ao comparar diferentes cepas e espécies de fungos. Comparações entre cepas podem ser difíceis na ausência de padronização detalhada, uma vez que diferentes cepas metabolizam substratos com diferentes capacidades²¹.