Charakterisierung eines pathogenen Escherichia coli-Stammes aus Oreochromis spp. Farmen mit Ganzgenomsequenzierung

Die Aquakultur ist einer der am schnellsten wachsenden lebensmittelproduzierenden Sektoren weltweit, und ihre Produktionspraktiken sollen die steigende Nachfrage nach Nahrungsmitteln für den menschlichen Verzehr befriedigen. Die weltweite Aquakulturproduktion hat sich von 34 Millionen Tonnen (Mt) im Jahr 1997 auf 112 Mt im Jahr 2017 verdreifacht¹. Die wichtigsten Artengruppen, die fast 75% der Produktion ausmachten, waren Algen, Karpfen, Muscheln, Wels und Tilapia (Oreochromis spp.) ¹. Das Auftreten von Krankheiten, die durch mikrobielle Einheiten verursacht werden, ist jedoch aufgrund der intensiven Fischzucht unvermeidlich, was zu potenziellen wirtschaftlichen Verlusten führt².

Der Einsatz von Antibiotika in der Fischzucht ist bekannt für die Vorbeugung und Behandlung bakterieller Infektionen, dem wichtigsten limitierenden Faktor für die Produktivität ^3,4. Dennoch reichern sich Restantibiotika in Aquakultursedimenten und im Wasser an, üben Selektionsdruck aus und verändern die fischassoziierten und die ansässigen Bakteriengemeinschaften 5,6,7,8. Folglich dient die Aquakulturumgebung als Reservoir für antimikrobielle Resistenzgene (ARGs) und das weitere Auftreten und die Ausbreitung antibiotikaresistenter Bakterien (ARB) im umgebenden Milieu⁹. Zusätzlich zu den bakteriellen Krankheitserregern, die häufig die Fischzuchtpraktiken beeinflussen, werden häufig Mitglieder der Enterobacteriaceae-Familie angetroffen, darunter humanpathogene Stämme von Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. und Salmonella ^spp.10. E. coli ist der häufigste Mikroorganismus, der aus Fischmehl und Wasser in der Fischzucht isoliert wird 11,12,13,14,15.

E. coli ist ein vielseitiges gramnegatives Bakterium, das den Magen-Darm-Trakt von Säugetieren und Vögeln als kommensales Mitglied ihrer Darmmikrobiota bewohnt. E. coli besitzt jedoch eine sehr anpassungsfähige Fähigkeit, sich in verschiedenen Umweltnischen wie Boden, Sedimenten, Nahrung und Wasser zu besiedeln und zu persistieren¹⁶. Aufgrund des Gengewinns und -verlusts durch das Phänomen des horizontalen Gentransfers (HGT) hat sich E. coli schnell zu einem gut angepassten antibiotikaresistenten Erreger entwickelt, der in der Lage ist, ein breites Spektrum von Krankheiten bei Mensch und Tier zu verursachen^17,18. Basierend auf dem isolierten Ursprung werden pathogene Varianten als intestinale pathogene E. coli (InPEC) oder extraintestinale pathogene E. coli (ExPEC) definiert. Darüber hinaus werden InPEC und ExPEC in genau definierte Pathotypen nach Krankheitsmanifestation, genetischem Hintergrund, phänotypischen Merkmalen und Virulenzfaktoren (VFs) unterteilt16,17,19.

Traditionelle Kultur- und molekulare Techniken für pathogene E. coli-Stämme haben den schnellen Nachweis und die Identifizierung verschiedener Pathotypen ermöglicht. Sie können jedoch zeitaufwendig und mühsam sein und erfordern häufig eine hohe technische Schulung¹⁹. Darüber hinaus kann aufgrund der Komplexität ihres genetischen Hintergrunds keine einzige Methode verwendet werden, um alle pathogenen Varianten von E. coli zuverlässig zu untersuchen. Derzeit wurden diese Nachteile mit dem Aufkommen von Hochdurchsatzsequenzierungstechnologien (HTS) überwunden. Whole-Genome Sequencing (WGS) -Ansätze und bioinformatische Werkzeuge haben die Erforschung mikrobieller DNA kostengünstig und in großem Maßstab verbessert und die eingehende Charakterisierung von Mikroben in einem einzigen Durchgang erleichtert, einschließlich eng verwandter pathogener Varianten^20,21,22. Abhängig von den biologischen Fragestellungen können mehrere bioinformatische Werkzeuge, Algorithmen und Datenbanken verwendet werden, um Datenanalysen durchzuführen. Wenn das Hauptziel beispielsweise darin besteht, das Vorhandensein von ARGs, VFs und Plasmiden zu bewerten, können Tools wie ResFinder, VirulenceFinder und PlasmidFinder zusammen mit den zugehörigen Datenbanken ein guter Ausgangspunkt sein. Carriço et ^al.22 gaben einen detaillierten Überblick über die verschiedenen Bioinformatik-Software und zugehörigen Datenbanken, die für die mikrobielle WGS-Analyse eingesetzt werden, von der Vorverarbeitung von Rohdaten bis zur phylogenetischen Inferenz.

Mehrere Studien haben den breiten Nutzen von WGS für die Genomabfrage in Bezug auf antimikrobielle Resistenzattribute, pathogenes Potenzial und die Verfolgung der Entstehung und evolutionären Beziehungen klinisch relevanter Varianten von E. coli aus verschiedenen Ursprüngen gezeigt^23,24,25,26 . WGS hat die Identifizierung molekularer Mechanismen ermöglicht, die der phänotypischen Resistenz gegen Antibiotika zugrunde liegen, einschließlich dieser seltenen oder komplexen Resistenzmechanismen. Dies geschieht durch den Nachweis erworbener ARG-Varianten, neuartiger Mutationen in Wirkstoffzielgenen oder Promotorregionen^27,28. Darüber hinaus bietet WGS das Potenzial, antimikrobielle Resistenzprofile abzuleiten, ohne dass Vorkenntnisse über den Resistenzphänotyp eines Bakterienstamms erforderlich^{sind 29}. Alternativ hat WGS die Charakterisierung der mobilen genetischen Elemente (MGEs) ermöglicht, die sowohl antimikrobielle Resistenz- als auch Virulenzmerkmale aufweisen, was die bakterielle Genomevolution bestehender Krankheitserreger vorangetrieben hat. Zum Beispiel führte die Anwendung von WGS während der Untersuchung des deutschen E. coli-Ausbruchs im Jahr 2011 zur Aufdeckung der einzigartigen genomischen Merkmale eines scheinbar neuartigen E. coli-Pathotyps; Interessanterweise stammten diese Ausbruchsstämme aus der enteroaggregativen E. coli (EAEC) -Gruppe, die den Prophagen, der das Shiga-Toxin kodiert, aus dem enterohämorrhagischen E. coli (EHEC) Pathotyp³⁰ erwarb.

Diese Arbeit stellt eine methodische Anpassung des Workflows für bakterielle WGS mit einem Tischsequenzer vor. Darüber hinaus wird eine Bioinformatik-Pipeline mit webbasierten Werkzeugen bereitgestellt, um die resultierenden Sequenzen zu analysieren und Forscher mit begrenzter oder keiner bioinformatischen Expertise weiter zu unterstützen. Die beschriebenen Methoden ermöglichten die Aufklärung der antimikrobiellen Resistenz, Virulenz und Mobilommerkmale eines pathogenen E. coli-Stammes ACM5, der 2011 aus Oreochromis spp. aus Binnenzucht in Sinaloa, Mexiko^{isoliert wurde 12}.