超解像顕微鏡は、減数分裂におけるシナプトン複合体内の成分の構成に関する詳細な洞察を提供することができます。ここでは、 カエノラブディティス・エレガンス ・シナプトン複合体の個々のタンパク質を分解するためのプロトコルを示します。
減数分裂の間、相同染色体はそれらの正しい分離を可能にするために互いに認識して付着しなければならない。相同染色体の相互作用を確保する重要な事象の1つは、減数分裂前期Iにおけるシナプトン複合体(SC)の集合である。異なる種間のSC内のタンパク質成分間の配列相同性はほとんどありませんが、SCの一般的な構造は進化の過程で高度に保存されています。電子顕微鏡写真では、SCは、横方向の要素または軸、横方向のフィラメント、および中央の要素で構成される三部構成のはしごのような構造として表示されます。
しかし、SCの分子構造を決定するために電子顕微鏡法によって複合体内の個々の成分の局在を正確に同定することは依然として困難である。対照的に、蛍光顕微鏡法は、複合体内の個々のタンパク質成分の同定を可能にする。しかし、SCの幅は~100 nmしかないため、その下部構造は回折制限のある従来の蛍光顕微鏡では解決できません。したがって、SCの分子構造を決定するには、構造化照明顕微鏡(SIM)、誘導放出枯渇(STED)顕微鏡、または単一分子局在顕微鏡(SMLM)などの超解像光学顕微鏡技術が必要です。
SC内の個々の成分の構造と相互作用を維持するためには、生殖細胞内の本来の環境に近い環境で複合体を観察することが重要です。したがって、SMLMおよびSTED顕微鏡を使用して、無傷の押し出し カエノラブディティスエレガンス 生殖細胞系列組織におけるSCの下部構造の研究を可能にする免疫組織化学およびイメージングプロトコルを実証します。組織をカバーガラスに直接固定することで、イメージング中のサンプルの動きを減らし、サンプルの収差を最小限に抑えて、SCの下部構造を生物学的コンテキストで視覚化するために必要な高解像度を実現します。
減数分裂中に染色体の数を半分に減らすことは、有性生殖生物に健康な子孫を生み出すための鍵です。この染色体数の減少を達成するためには、相同染色体は減数分裂Iの間に対になって分離しなければならない。相同染色体の正確な分離を確実にするために、生殖細胞は拡張前期Iを受け、その間に相同染色体がペアになり、シナプス、および再結合して、ホモログ間の物理的リンクを生成します1。SCは、減数分裂前期2の正しい進行を調節する上で重要な中心的な構造として浮上しています。
SCは、そのタンパク質成分間にほとんど相同性がないにもかかわらず、その一般的な構造が進化的に保存されている複合体です。SCは、電子顕微鏡写真で、2つの横方向の要素または軸、横方向のフィラメントによって形成された中央領域、および中央の要素3,4からなる三者のはしご状の構造として最初に特定されました。複合体内の個々のコンポーネントの構成を決定することは、減数分裂前期におけるSCの役割の理解を深めるための鍵です。
モデル生物C.エレガンスは、その生殖系列が完全に組み立てられたSCを持つ多数の減数分裂核を含むため、SCの構造と機能を研究するのに理想的です5。遺伝学的および生化学的研究により、染色体軸は、C.エレガンスのHTP-1/2/3およびHIM-3 7,8,9,10,11と呼ばれる3つの異なるコヒーシン複合体6,7および4つのHORMAドメインタンパク質によって形成されることが明らかになりました。SCの中央領域では、コイルドコイルドメインを含む6つのタンパク質がこれまでに同定されています12、13、14、15、16、17。2つの軸間の距離を埋めるために、SYP-1、-5、および-6は直接対決的に二量体化し(図1)、3つの追加のタンパク質が中央要素16、17、18、19での相互作用を安定化させます。
これらのタンパク質の構成に関する詳細な洞察を得ることは、減数分裂中のSCの多くの機能を理解するために不可欠です。SCの中央領域の幅は~100 nmしかないため、その下部構造は回折限界蛍光顕微鏡では解像できません。ただし、このサイズの構造内のコンポーネントの視覚化は、超解像顕微鏡によって容易に達成できます。実際、構造化照明顕微鏡(SIM)、膨張顕微鏡20、誘導放出枯渇(STED)顕微鏡21、および単一分子局在顕微鏡(SMLM)22,23は、種全体のSCの分子構造を研究するための不可欠なツールとして浮上しています16,24,25,26,27,28,29、30。
分解能の限界を克服するために、STED顕微鏡は、発光光の回折制限スポットをSTEDレーザーからのドーナツ状のビームでオーバーレイすることに依存しており、理論的には点像分布関数を分子寸法31,32に制限します。しかし、生体試料内でSTEDによって実際に達成可能な分解能は、xy33では数十ナノメートルの範囲にとどまっています。
SMLM技術を使用すると、生物学的サンプルのさらに高い分解能を得ることができます。SMLMは、特定の蛍光色素の点滅特性を利用して、空間的に重なり合う蛍光色素を時間的に分離することにより、サブ回折レベルでオブジェクトを分離します。次に、サンプルを繰り返しイメージングして、蛍光色素のさまざまなサブセットを捕捉します。次に、サンプル内の蛍光色素の位置は、すべての画像で得られたシグナルに点像分布関数(PSF)を当てはめることによって決定され、15 nmまでの構造を分解できます23,34。
まとめると、局所化された画像はすべての蛍光色素の位置をエンコードします。SMLMの分解能は、標識密度と蛍光色素のブリンキング特性によって決まります。ナイキスト-シャノン基準によれば、ラベル間平均距離の2倍未満のオブジェクトを確実に解決することは不可能です。したがって、高解像度のイメージングには高い標識密度が必要です。 C. elegansのSCでは、ゲノム編集を用いて内因性タンパク質の特定の部位に結合したエピトープタグを用いることで、高い標識密度を達成することができます。次いで、エピトープタグは、高い親和性を有する特異的モノクローナル抗体を用いて高密度で染色することができる19、30。同時に、個々の蛍光色素のオンサイクルは、空間的に重なり合う蛍光色素が同時に捕捉されないように十分に短くなければなりません35。
この2つの要件により、SCのような大きな高分子複合体の構造を解像するには、十分な数の画像をイメージングする必要があり、数時間かかることがあります。イメージング時間が長いことの落とし穴は、ステージの動きやサンプルバッファー内の小さな電流によってサンプルがドリフトする傾向があることです。10 nmオーダーの小さな動きでも、nmの分解能では有害であり、補正する必要があります。しかしながら、一般的に使用されるドリフト補正方法は、順次画像化された2つのチャネルの画像を正確にオーバーレイするのに十分なほど堅牢ではない36。生物学的な質問では、同じサンプル内の複数のターゲットの正確な検出と局在化が求められることが多いため、これは問題があります。これらの問題を回避するために、レシオメトリックイメージングなどの方法が開発されてきた。レシオメトリックイメージングでは、励起スペクトルと発光スペクトルが重なり合う複数の蛍光色素を同時にイメージングし、その後、スペクトル的に異なるチャネルの強度比に基づいて、検出された各シグナルをそれぞれの蛍光色素に割り当てることができます37,38。
さらに、SCのような高分子複合体の構成を研究するには、3次元(3D)情報が必要です。3次元超解像(3D-SMLM)を実現するために、放射光の光路にシリンドリカルレンズが組み込まれており、焦点面からの距離に応じて蛍光色素のPSFの形状が歪んでいます。したがって、z平面内の蛍光色素の正確な位置は、その発光信号の形状を分析することによって外挿することができます35,39。SMLMにおけるこれらの進歩を組み合わせることで、SCを含む高分子複合体の3D組織のイメージングが可能になります。
相同染色体の正しい組換えと分離に不可欠なSCのはしごのような組織は、ほぼ70年前に電子顕微鏡で最初に観察されました3,4。SCの全体的な構成は電子顕微鏡で容易に解決されますが、この複合体内の個々のコンポーネントの局在化には、より的を絞ったアプローチが必要です。幅が~100 nmしかないSCの下部構造は、従来の蛍光顕微鏡では解決できません。しかし、超解像顕微鏡は、シナプトン複合体の構造と機能に関する新しい発見の主要な推進力となっています16、19、24、25、26、27、28、29、30。この研究を容易にするために、SMLMおよびSTED顕微鏡を使用してC.エレガンス生殖腺組織内のSCの構造を研究できる取り付け手順を示しました。
SMLMイメージングの解像度を最適化するための重要なステップは、生殖細胞系列組織をポリ-L-リジンコーティングカバーガラスに直接架橋することです(ステップ4)。カバーガラスへの組織の共有結合は、大きなドリフトをもたらし、SMLMの長期間にわたるイメージングを不可能にするサンプル内の動きを減らすために不可欠です。さらに、カバーガラスから離れたSCを含む核を残す次善のアタッチメントでさえ、球面収差に起因する達成可能な分解能の大幅な低下につながります(図4)。ここで使用される共有結合付着物に代えて、染色された生殖細胞系列組織は、画像化緩衝液19、30の小滴中の2つの密封カバーガラスの間に固定化することもできる。しかしながら、この固定化法は、サンプル中のイメージングバッファーの体積を、ここで最適化されたプロトコルで使用される1mLからわずか数μLに大幅に減少させ、イメージングバッファーの酸性化をもたらし、サンプルをイメージングできる時間を大幅に短縮します38,53,54。
SMLM顕微鏡とSTED顕微鏡の両方で取得時間が長いため、これらの方法の使用は化学的に固定されたサンプルのイメージングに制限されます。ここで、パラホルムアルデヒド固定により、サンプル調製およびイメージング中にSCの構造が確実に保存されます。しかしながら、無傷の組織内のSCを画像化するためにここで取られた予防措置にもかかわらず、固定後に生じるSCの構造は、生体内のその天然状態の構造と必ずしも同一ではない。さらに、固定SCの単一の画像は生物学的構造の単一の「スナップショット」を表すので、このアプローチはin vivoのネイティブ構造のダイナミクスに盲目のままです。
しかし、高分子構造のダイナミクスや変動性に関する情報は、1枚だけでなく多くの「スナップショット」を取得することでも得られます。このアプローチは、pachytene19中のSCの構造の変化を解決することができるが、このプロトコルを使用して調製された単一のサンプルから取得できる画像の数を制限するいくつかの要因がある。まず、画像取得時に使用される高いレーザー出力は、蛍光色素の永久的な漂白をもたらし、隣接する関心領域または複数のz平面のイメージングを妨げるため、単一のサンプルから取得できる画像の数が大幅に減少します。第2に、この方法で調製されたカバーガラス上のサンプル/組織密度が低く、単一のカバーガラスから取得できる画像の数が大幅に制限されます。サンプル密度が低いため、他の生物学的問題に光を当てるのに役立つ自動画像取得パイプラインの使用も禁止されています34,55,56,57,58,59。ただし、経験豊富なユーザーはサンプル密度をわずかに増やすことができます。
ここで紹介するプロトコルは、SMLM35で最適な分解能を達成するために必要な高い標識密度を得るために最適化されています。以前のプロトコルは、免疫染色の前に組織をカバーガラスに共有結合していましたが16、この新しいプロトコルは、サンプルが溶液で染色された後にのみ、組織をカバーガラスに架橋します。この修飾により、免疫標識に使用される抗体は、あらゆる側面から組織に自由にアクセスすることができるが、カバーガラスへの組織の共有結合は、抗体がカバーガラスに最も近い核に到達するのを制限し、それによって標識の程度を低下させる可能性がある。ここで説明する変更により、分解能が40-50 nm(FRC分解能)16 から30-40 nm(このプロトコル)に向上します。
重要なことに、SMLMには高い標識密度と高濃度の抗体が不可欠ですが、より低い抗体濃度を使用すると、より良いSTED顕微鏡画像が得られることがわかりました(ステップ3)。数十ナノメートルの分解能では、目的のタンパク質を標識するために使用される分子のサイズがますます重要になります。そこで、完全長抗体の半分の大きさのF(ab’)2フラグメントを採用しました。より小さなシグナル源による局所コントラストの改善、したがって完全長二次抗体を使用した場合と比較してこの修飾によって得られた分解能により、TauSTEDによる中央領域内のSYP-5の2つのC末端の分解能が可能になりましたが、これは完全長抗体を使用した従来のSTEDでは解決されません(16 およびデータは示されていません)。我々は、無傷の C.エレガンの生殖細胞系列におけるSCをイメージングするためのこの最適化されたプロトコルが、減数分裂中のSCの構造機能関係の調査を容易にすることを期待しています。
The authors have nothing to disclose.
SMLMイメージング用のイメージングバッファーを共有してくれたJonas RiesとRiesラボに感謝します。また、このプロトコルで使用されている C.エレガンス 株のキムユミとニワトリ抗HTP-3抗体のアビーF.ダーンバーグにも感謝します。EMBLハイデルベルクの先端光学顕微鏡施設のマルコ・ランペ氏とステファン・テルユング氏が、オリンパスiXplore SPIN共焦点顕微鏡の使用をサポートしてくれたことに感謝します。この研究は、欧州分子生物学研究所とドイツ研究財団(DFG、ドイツ研究財団-452616889、SK)の支援を受けました。私たちは、ベーリンガーインゲルハイム財団によって寛大に支援された、欧州分子生物学研究所(EMBL IC)のイメージングセンターによって提供されるアクセスとサービスを認めます。
100x/1.5 oil objective | Olympus | UPLAPO100XOHR | UPLAPO100XOHR |
2-mercaptoethylamine (MEA) | Sigma-Aldrich | 30070-10G | Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH 8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 °C. |
Additional 640 nm booster laser | Toptica | IBEAM-SMART-640-S-HP | |
AlexaFluor 594, NHS ester | ThermoFischer Scientific | A37572 | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
AlexaFluor 647, NHS ester | ThermoFischer Scientific | A37573 | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
anti-HA | Thermo Fisher Scientific | 2-2.2.14 | Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
anti-HTP-3 | a gift from Abby F. Dernburg | MacQueen et al., 2005 | Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
Caenorhabditis elegans strain YKM349 | a gift from Yumi Kim | Hurlock et al., 2020 | syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II |
CF6680, NHS ester | Biotium | 92139 | Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
Circular cover glass 12 mm No. 1 | Menzel-Gläser; VWR | 631-0713 | |
Circular cover glass 24 mm No. 1.5 | Carl Roth | PK26.1 | |
Cylindrical lenses | Thorlabs | LJ1516RM-A, LK1002RM-A | |
Egg Buffer (10x) | Edgar 1995 | 250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4 | |
Ethanol (absolute for analysis) | Merck | 64-17-5 | |
F(ab’)2 fragment anti-chicken IgY | Jackson Immunoresearch | AB_2340347 | Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
F(ab’)2 fragment anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | AB_2340761 | Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick | Fisher scientific | 7107 | |
Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm – Iridium 10% | Kisker | 789265 | |
Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat ) | a gift from Jonas Ries | Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 | 20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155), 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 °C. |
Imaging buffer base | a gift from Jonas Ries | Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 | 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose. Aliquoted to a single-use volume (950 μL), frozen, and kept at -80 °C. |
Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36982 | |
Leica Stellaris 8 STED FALCON | Leica | N/A | The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample. Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut. |
Longwave channel emission filter | AHF Analysentechnik | F47-702 | 700/100 nm bandpass |
Methanol (absolute for analysis) | Merck | 67-56-1 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich/Merck | S5761-500G | 100 mM NaHCO3, pH 8.3 |
Near-infrared fiber-coupled laser | Toptica | IBEAM-SMART-PT-CD | Custom Design, 808 nm – 75mW |
Objective lens piezo mount (PIFOC ) | Physik Instrumente | P-726.1.CD | 100 µm travel range |
Orca Fusion BT sCMOS camera | Hamamatsu | C15440-20UP | |
PCR tubes | Greiner Bio-One | 673283 | 0.2 mL |
Phosphate Saline Buffer (PBS 10x) | N/A | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 | |
Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free | ThermoFischer Scientific | 28906 | 16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature. |
PlasmaPrep2 plasma cleaner | GaLa Instrumente GmbH | N/A | |
Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich/Merck | P2636-25MG | 0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 °C. |
Primary dichroic (illumination reflecting) | AHF Analysentechnik | F73-866S | quad bandpass @ 405, 488, 561, 640 |
Quadnotch filter | AHF Analysentechnik | F40-072 | 405/488/561/640 nm |
Quadrant photodiode (QPD) | Laser Components | SD197-23-21-041, LC301DQD-PV | |
Razor blades | Apollo Herkenrath Solinger | N/A | |
Refractive beam shaper | AdlOptica | PiShaper 6_6_VIS | |
Roche Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | 10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 °C. |
Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3) | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110911 | |
Scalpel removal box | Fisher scientific | 10002-50 | |
Secondary dichroic (emission reflecting) | AHF Analysentechnik | F38-785S | 750 nm longpass |
Shortpass filter | Semrock | BSP01-785R-25 | 750 nm |
Shortwave channel emission filter | AHF Analysentechnik | F37-677 | 676/37 nm bandpass |
Single molecule localization microscope | EMBL Imaging Centre | Diekmann et al., 2020 with modifications | The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm. For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking). A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging. To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 – 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount. For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de |
Single-mode fiber-coupled multi-laser engine | Toptica | iCHROME MLE-LFA-HP | Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm |
Splitting dichroic | AHF Analysentechnik | F48-665SG | 665 nm long pass |
Square cover glass 22 x 22 mm No.1 | Menzel-Gläser; VWR | 630-2882 | |
STAR 635P, NHS ester | Abberior | ST635P-0002-1MG | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB | Zeiss | N/A | |
Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich/Merck | T1512-2G | 1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 °C. Thawed aliquot was kept at 4 °C and used for several months. |
TetraSpeck Microspheres | ThermoFischer Scientific | T7279 | 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red |
Tris Saline Buffer (TBS 10x) | N/A | 200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich/Merck | P9416-50ML | Kept at room temperature in original packaging. |
WormStuff worm pick | Kisker | 789277 | |
XY microscope stage | Smaract | N/A | Custom Design |
Zeba Micro Spin Desalting Column | ThermoFischer Scientific | 89877 | 7K MWCO, 75 µL |