JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Caenorhabditis elegans Germline İçindeki Sinaptonemal Kompleksin Süper Rezolüsyonlu Mikroskopisi

Published: September 13, 2022
doi:
10.3791/64363
, , , ,
1Cell Biology and Biophysics,European Molecular Biology Laboratory, 2Collaboration for joint PhD degree between EMBL and Heidelberg University,Faculty of Biosciences, 3EMBL Imaging Centre,European Molecular Biology Laboratory

Summary

Süper çözünürlüklü mikroskopi, mayozdaki sinaptonemal kompleks içindeki bileşenlerin organizasyonu hakkında ayrıntılı bir fikir verebilir. Burada, Caenorhabditis elegans synaptonemal kompleksinin bireysel proteinlerini çözmek için bir protokol gösteriyoruz.

Abstract

Mayoz sırasında, homolog kromozomlar doğru ayrışmalarına izin vermek için birbirlerini tanımalı ve birbirine yapışmalıdır. Homolog kromozomların etkileşimini güvence altına alan anahtar olaylardan biri, mayotik faz I’de sinaptonemal kompleksin (SC) birleşmesidir. Farklı türler arasında SC içindeki protein bileşenleri arasında çok az dizi homolojisi olmasına rağmen, SC’nin genel yapısı evrim sırasında oldukça korunmuştur. Elektron mikrograflarında, SC, yanal elemanlardan veya eksenlerden, enine filamentlerden ve merkezi bir elemandan oluşan üçlü, merdiven benzeri bir yapı olarak görünür.

Bununla birlikte, SC’nin moleküler yapısını belirlemek için kompleks içindeki bireysel bileşenlerin lokalizasyonunu elektron mikroskobu ile kesin olarak tanımlamak zor olmaya devam etmektedir. Buna karşılık, floresan mikroskopi, kompleks içindeki bireysel protein bileşenlerinin tanımlanmasına izin verir. Bununla birlikte, SC sadece ~ 100 nm genişliğinde olduğundan, alt yapısı kırınım sınırlı geleneksel floresan mikroskobu ile çözülemez. Bu nedenle, SC’nin moleküler mimarisinin belirlenmesi, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM), uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu veya tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) gibi süper çözünürlüklü ışık mikroskobu teknikleri gerektirir.

SC içindeki bireysel bileşenlerin yapısını ve etkileşimlerini korumak için, kompleksi germ hücrelerindeki doğal ortamına yakın bir ortamda gözlemlemek önemlidir. Bu nedenle, SMLM ve STED mikroskobu ile sağlam, ekstrüde Caenorhabditis elegans germline dokusunda SC’nin alt yapısının incelenmesini sağlayan bir immünohistokimya ve görüntüleme protokolü sunuyoruz. Dokunun doğrudan kapak kapağına sabitlenmesi, görüntüleme sırasında numunelerin hareketini azaltır ve SC’nin altyapısını biyolojik bağlamında görselleştirmek için gereken yüksek çözünürlüğü elde etmek için numunedeki sapmaları en aza indirir.

Introduction

Mayoz sırasında kromozom sayısını yarı yarıya azaltmak, cinsel olarak üreyen organizmalarda sağlıklı soy üretmenin anahtarıdır. Kromozom sayısındaki bu azalmayı sağlamak için, homolog kromozomlar mayoz I sırasında eşleşmeli ve ayrılmalıdır. Homolog kromozomların doğru bir şekilde ayrılmasını sağlamak için, germ hücreleri, homolog kromozomların homologlar1 arasında fiziksel bağlantılar oluşturmak için eşleştiği, sinaps yaptığı ve yeniden birleştiği genişletilmiş bir faz I’e maruz kalır. SC, mayotik faz2 yoluyla doğru ilerlemeyi düzenlemede anahtar olan merkezi yapı olarak ortaya çıkmıştır.

SC, protein bileşenleri arasında çok az homoloji olmasına rağmen, genel yapısı evrimsel olarak korunan bir komplekstir. SC ilk olarak elektron mikrograflarında iki yanal eleman veya eksenden oluşan üçlü, merdiven benzeri bir yapı, enine filamentlerin oluşturduğu merkezi bir bölge ve merkezi bir element 3,4 olarak tanımlanmıştır. Kompleks içindeki bireysel bileşenlerin organizasyonunu belirlemek, mayotik profaz sırasında SC’nin rolü hakkındaki anlayışımızı ilerletmenin anahtarıdır.

Model organizma C. elegans, SC’nin yapısını ve işlevini incelemek için idealdir, çünkü germ hatları tamamen monte edilmiş SCs5 ile çok sayıda mayotik çekirdek içerir. Genetik ve biyokimyasal çalışmalar, kromozom eksenlerinin, C. elegans’ta HTP-1/2/3 ve HIM-3 7,8,9,10,11 olarak adlandırılan üç ayrı kohezin kompleksi 6,7 ve dört HORMA alan proteini tarafından oluşturulduğunu ortaya koymuştur. SC’nin merkezi bölgesinde, sarmal bobin alanları içeren altı protein bugüne kadar 12,13,14,15,16,17 tanımlanmıştır. İki eksen arasındaki mesafeyi köprülemek için, SYP-1, -5 ve -6 kafa kafaya bir şekilde dimerize olurken (Şekil 1), üç ek protein isemerkezi element 16,17,18,19’daki etkileşimlerini stabilize eder.

Bu proteinlerin organizasyonu hakkında ayrıntılı bilgi edinmek, SC’nin mayoz sırasındaki birçok fonksiyonunu anlamada esastır. SC’nin merkezi bölgesinin genişliği sadece ~ 100 nm olduğundan, alt yapısı kırınım sınırlı floresan mikroskobu ile çözülemez. Bununla birlikte, bu boyuttaki bir yapı içindeki bileşenleri görselleştirmek, süper çözünürlüklü mikroskopi ile kolayca elde edilebilir. Gerçekten de, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM), genleşme mikroskobu 20, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu 21 ve tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM)22,23, SC’nin moleküler mimarisini 16,24,25,26,27,28,29 türleri arasında incelemek için gerekli araçlar olarak ortaya çıkmıştır. 30.

Çözünürlük sınırının üstesinden gelmek için, STED mikroskopisi, emisyon ışığının kırınım sınırlı noktasını, STED lazerden gelen çörek şeklindeki bir ışınla kaplamaya dayanır ve bu da teorik olarak nokta yayılma fonksiyonunu moleküler boyutlara kadar daraltır31,32. Bununla birlikte, biyolojik örnekler içinde STED tarafından pratik olarak elde edilebilen çözünürlük, xy33’te birkaç on nanometre aralığında kalmaktadır.

SMLM teknikleri ile biyolojik örneklerde daha da yüksek çözünürlük elde edilebilir. SMLM, mekansal olarak örtüşen floroforları zaman içinde ayırarak nesneleri alt kırınım seviyesinde çözmek için spesifik floroforların yanıp sönme özelliklerinden yararlanır. Numune daha sonra floroforların farklı alt kümelerini yakalamak için tekrar tekrar görüntülenir. Floroforların numune içindeki konumu daha sonra, nokta yayılma fonksiyonunun (PSF) tüm görüntülerde elde edilen sinyallere takılmasıyla belirlenir ve bu da yapıları 15 nm 23,34’e kadar çözebilir.

Birlikte ele alındığında, lokalize görüntüler tüm floroforların konumlarını kodlar. SMLM’nin çözünürlüğü, etiketleme yoğunluğu ve floroforun yanıp sönen özellikleri ile belirlenir. Nyquist-Shannon kriterine göre, ortalama etiket-etiket mesafesinin iki katından daha az olan nesneleri güvenilir bir şekilde çözmek imkansızdır. Bu nedenle, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için yüksek bir etiketleme yoğunluğuna ihtiyaç vardır. C. elegans’taki SC için, genom düzenleme kullanılarak endojen proteinlerin belirli bölgelerine bağlı epitop etiketleri kullanılarak yüksek bir etiketleme yoğunluğu elde edilebilir. Epitop etiketleri daha sonra yüksek afiniteleri19,30 olan spesifik monoklonal antikorlar kullanılarak yüksek yoğunlukta boyanabilir. Aynı zamanda, bireysel floroforların döngü süresi, mekansal olarak örtüşen floroforların aynı anda yakalanmamasını sağlayacak kadar kısa olmalıdır35.

Bu iki gereksinim nedeniyle, SC gibi büyük makromoleküler komplekslerin yapısını çözmek, yeterince fazla sayıda görüntünün görüntülenmesini gerektirir ve bu nedenle birkaç saat sürebilir. Uzun görüntüleme sürelerinin tuzağı, numunelerin sahnenin hareketi veya numune tamponu içindeki küçük akımlar nedeniyle sürüklenme eğiliminde olmasıdır; 10 nm mertebesindeki küçük hareketler bile nm çözünürlükte zararlıdır ve düzeltilmesi gerekir. Bununla birlikte, yaygın olarak kullanılan sapma düzeltme yöntemleri, sırayla görüntülenen iki kanalın görüntülerini doğru bir şekilde bindirmek için yeterince sağlam değildir36. Bu sorunludur, çünkü biyolojik sorular genellikle aynı numune içindeki birden fazla hedefin kesin tespitini ve lokalizasyonunu ister. Bu sorunları aşmak için, oranmetrik görüntüleme gibi yöntemler geliştirilmiştir. Oranmetrik görüntüleme, örtüşen uyarma ve emisyon spektrumlarına sahip çoklu floroforların eşzamanlı görüntülenmesine izin verir ve tespit edilen her sinyalin, spektral olarak farklı kanallardaki yoğunlukların oranına bağlı olarak kendi floroforuna atanmasını sağlar37,38.

Ek olarak, SC gibi makromoleküler komplekslerin organizasyonunu incelemek, üç boyutlu (3B) bilgi gerektirir. Üç boyutta (3D-SMLM) süper çözünürlük elde etmek için, yayılan ışığın optik yoluna, odak düzleminden uzaklığına bağlı olarak bir floroforun PSF’sinin şeklini bozan silindirik bir lens dahil edilmiştir. Bu nedenle, bir floroforun z-düzlemindeki kesin konumu, emisyon sinyali35,39’un şeklini analiz ederek tahmin edilebilir. SMLM’deki bu ilerlemeleri birleştirmek, SC de dahil olmak üzere makromoleküler komplekslerin 3D organizasyonunun görüntülenmesini sağlar.

Protocol

1. Çözeltilerin ve kapakların hazırlanması NOT: Tüm malzemeler ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna ve bu protokolde kullanılan çözeltilerin bileşimi için Tablo 1’e bakınız. Poli-L-lizin kaplı kapak kapakları% 0.01 (w / v) poli-L-lizin hazırlayın (bakınız Tablo 1). Hassas bir kapak kapağını (24 mm çap; 0,17 ± 0,005 mm, No. 1,5) etanol içinde 10-30 dakika boyunca yıkayın. Etanol çıkarmak için kapak kaymasını ddH2O ile durulayın ve kapak kaymasını oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Plazma, bir plazma temizleyici kullanarak kapak kapağını temizler.NOT: Plazma temizliği, kapak kaymasının hidrofilikliğini arttırır ve aşağıdaki adımları kolaylaştırır. Bir plazma temizleyici mevcut değilse, bu adım atlanabilir, ancak bu, poli-L-lizin çözeltisinin hacminin ve / veya konsantrasyonunun ayarlanmasını gerektirebilir. Bu değişiklik test edilmemiştir. Kapak kapağına %0,01 (w/v) poli-L-lizinden bir damla (120 μL) yerleştirin. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, kapak kaymasını ddH2O’da durulayın ve oda sıcaklığında kurutun. 4 °C’de 1 aya kadar saklayın. F(ab’)2 parçaları floresan organik boyalarla konjuge edilmişBir PCR tüpüne aşağıdaki sırayla ekleyin: PBS’de 10 μL 0.6-0.7 mg / mL F (ab’)2 fragmanı, 1 μL 0.1 M NaHCO 3 (pH8.3 ) ve DMSO’da 1 mM süksinimidil (NHS) ester reaktif floroforun 1 μL (F (ab’)2: boyanın molar oranı ~ 1: 17’dir). Yukarı ve aşağı pipetle çekerek iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. F(ab’)2 parçasını, üreticinin spesifikasyonlarına uygun olarak bir tuz giderme sütunu (7K MWCO) kullanarak kalan serbest reaktif boyadan ayırın. Kolonun dengelenmesi ve etiketli F(ab’)2 parçasının elüsyonu için 1x PBS kullanın. Etiketli F(ab’)2 parçasını 4 °C’de 3 aya kadar saklayın.NOT: 3 aydan uzun depolama süreleri test edilmemiştir. 2. Diseksiyon ve fiksasyon NOT: Diseksiyon ve fiksasyon prosedürleri, süper çözünürlüklü mikroskopi için en uygun örnekleri elde etmek için daha önce önerilen prosedürler 16,40’tan değiştirilmiştir. DiseksiyonuYaşa uygun C. elegans solucanlarını (bu çalışma için 20 ° C’de yetiştirilen) bir kapak kayması (22 mm x 22 mm, No. 1) üzerinde 30 μL’lik bir EBTT damlasına (% 0.2 iyonik olmayan deterjanla 1x Yumurta tamponu41) seçin. Daha kolay manipülasyon için kapak kaymasını cam bir kızağın üzerine yerleştirin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek 30 μL EBTT ile yıkayın. Kapak kayması üzerinde 30 μL’lik bir damla bırakmak için çözeltinin 30 μL’sini çıkarın.NOT: Solucanların plastik uçlara yapışmasını önlemek için solucanların pipetlendiği tüm çözeltilere az miktarda iyonik olmayan deterjan eklenmelidir. Gonadı ekstrüzyon yapmak için solucanların kafalarını ve / veya kuyruklarını kesmek için bir neşter bıçağı kullanın (Şekil 2A). FiksasyonPipet 30 μL fiksatif çözelti (Tablo 1) içine disseke solucanlar damla ve pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için.NOT: Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetlemek daha fazla gonadın serbest bırakılmasına yardımcı olabilir. Fiksatif çözeltiyi ekledikten sonra tam olarak 1 dakika boyunca düzeltin. Solucanları TBST ile doldurulmuş bir PCR tüpüne aktararak fiksasyonu durdurun (Tablo 1). Solucanları mümkün olduğunca az hacimde (~ 15 μL) aktarın. PCR tüpünü mini tezgah üstü santrifüjde (2.000 × g, 10 sn) döndürün. Süpernatantı çıkarın ve her biri 200 μL TBST ile 2 kat yıkayın. 5-10 dakika boyunca 200 μL PBST (Tablo 1) ile yıkayın. Disseke edilmiş numuneleri buz üzerinde tutarken en fazla dört numune için 2.1.1 ile 2.2.5 arasındaki adımları tekrarlayın.NOT: Dörtten fazla numune işleniyorsa, numune fiksasyonunun tüm numunelerde tutarlı kalmasını sağlamak için her dört numuneden sonra 2.2.6 ila 2.2.7 arasındaki adımlarla devam edin. Disseke edilmiş numuneleri mini bir tezgah üstü santrifüj (2.000 × g, 10 sn) üzerinde döndürün, PBST’yi çıkarın ve 50-100 μL soğuk metanol (-20 ° C) ekleyin.DİKKAT: Metanol toksiktir. Koruyucu ekipman giyin ve solunmasından kaçının. Yukarı ve aşağı pipetleyerek, numuneleri metanol içinde 30-60 sn bekletin. Numuneleri 200 μL PBST’de 2 kat yıkayın.NOT: Dörtten fazla numune işleniyorsa, kalan numunelerin diseksiyonuna devam edin (adım 2.1.1 ila 2.2.7). Numuneleri 200 μL PBST ile üçüncü kez yıkayın. 3. Antikor inkübasyonları EngellemeNumuneleri oda sıcaklığında 45-60 dakika boyunca 1x Blokaj Çözeltisinde (Tablo 1) bloke edin.NOT: Kuluçka süresi oda sıcaklığında 30 dakikadan 4 ° C’de birkaç güne kadar değişebilir (test 3 güne kadar yapılmıştır). Birincil antikor çözeltisiAnti-HTP-3 (tavuk42) ve anti-HA (fare) antikorlarını (veya tercih edilen antikorları) çalışma çözeltilerine (SMLM için 1:250 ve STED mikroskopi örnekleri için 1:1.000) 1x Bloke Çözeltisinde seyreltin.NOT: SMLM örneklerini etiketlemek için kullanılan antikorlar, SMLM mikroskopisi için daha yüksek bir etiketleme yoğunluğu önerildiğinden, STED örneklerinden daha konsantredir. Numuneleri mini bir tezgah üstü santrifüj (2.000 × g, 10 s) üzerinde döndürün, bloke edici tamponu çıkarın ve birincil antikor çözeltisinden 30-50 μL ekleyin. Gece boyunca 4 ° C’de (tercih edilen) veya oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, PBST ile 3 x 5-15 dakika yıkayın. Floresan boyaya konjuge edilmiş F(ab’)2 parçalarının çalışma çözeltisiEtiketli F(ab’)2 parçalarını (adım 1.2.4) 1x Bloke Çözeltisinde çalışma çözeltilerine (SMLM için 1:100 ve STED mikroskopi örnekleri için 1:1.000) seyreltin.NOT: Her iki süper çözünürlük tekniği için, daha önce bildirilen florofor çiftleri, yani SMLM için AlexaFluor647 / CF680 ve STED için AlexaFluor594 / Abberior STAR635P kullanılmıştır. AlexaFluor647 ve STAR645P, SYP-5’in C-terminusunu hedeflemek için fare karşıtı (Fab’)2 parçalarını ve HTP-3’ü hedeflemek için CF680 / AlexaFluor594 etiketli anti-tavuk (Fab’)2 parçalarını etiketlemek için kullanıldı. Numuneleri mini bir tezgah üstü santrifüj (2.000 × g, 10 s) üzerine döndürün, PBST’yi çıkarın ve 30-50 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında (tercih edilen) 30 dakika ila 2 saat veya 4 ° C’de gece boyunca inkübe edin. PBST ile 3 x 5-15 dakika yıkayın. 4. Numunelerin bir kapak fişi üzerine monte edilmesi PostfixasyonNOT: Numuneleri 4.1.1-4.2.1 numaralı adımlarla tek tek işleyin.Lekeli örnekleri döndürün ve süpernatanı çıkarın. 50 μL PBST0,2 ekleyin ve lekeli solucanları 22 mm x 22 mm No. 1 kapak kayması üzerine aktarın.NOT: Solucanların kapak kaymasına yapışmasını önlemek için bu adım için tazePBST 0.2 ile %0,2 iyonik olmayan deterjan (Tablo 1) kullanın. Pipet 5.7-6.3 μL postfiksatif çözelti bir poli-L-lizin kapak kayması üzerine.NOT: 4 °C’de saklanan poli-L-lizin kapaklar öncelikle oda sıcaklığına getirilmelidir. Pipet, disseke edilmiş solucanları aynı hacimde (5.7-6.3 μL) çıkarır ve poli-L-lizin kapak kayması üzerindeki fiksatif damlasına aktarılır (Şekil 2B).NOT: Bu ve sonraki adımda, disseke edilmiş dokunun poli-L-lizin kaplı kapak kaymasının merkezinde tutulması çok önemlidir. Bu, özellikle numunelerin burada kullanılan özel yapım SMLM mikroskobuna uyacak şekilde özel bir tutucuya monte edilmesi durumunda önemlidir (bkz. adım 5.1, Şekil 2B). Numuneyi küçük bir kapak kapağıyla örtün (12 mm çap, Şekil 2B). Küçük bir filtre kağıdı parçası kullanarak fazla sıvıyı çıkarın (Şekil 2B). Karanlık bir odada 3-5 dakika boyunca sabitleyin. “Donma-çatlama”Numuneleri kuru buzda alüminyum bir blok üzerine yerleştirerek dondurun (Şekil 2B).NOT: Alüminyum blok, numuneleri üzerine yerleştirmeden önce kuru buzda iyice soğutulmalıdır. Kalan örneklerin postfiksasyonuna devam edin (adım 4.1.1 ila 4.2.1). Numunenin bir sonraki adımdan önce en az 20 dakika veya 1 saate kadar kuru buz üzerinde olması gerekir (4.2.2). Küçük kapak kapağını tıraş bıçağı kullanarak çıkarın (Şekil 2B).NOT: STED için adım 5.2.1’e geçin. SMLM için adım 4.2.3 ile devam edin. Kapak kapağını buz gibi soğuk PBS (tercih edilen) veya -20 °C metanol içeren 50 mL’lik konik bir tüpe yaklaşık 10 s batırın.NOT: Sıcaklık bu adım için çok önemli bir faktördür. Bu nedenle, taze çözülmüş veya bir buz / etanol banyosunda tutulan PBS kullanın. Kapak kapağını PBST tamponuyla doldurulmuş altı delikli bir plakanın kuyucuğuna yerleştirin. PBST’yi kuyucuklardan çıkarın ve taze PBS ekleyin. Örnekleri PBS’de 5 dakika bekletin.NOT: Numunelerin zarar görmesini ve sökülmesini önlemek için PBS’yi kuyunun kenarına pipetin. Taze PBS ile yıkayın ve görüntülemeye kadar numuneleri 4 °C’de bırakın.NOT: Numuneler 2 haftaya kadar stabildir, ancak numuneler 2 gün içinde görüntülendiğinde en iyi sonuçlar elde edilir. Görüntülemeden önce, numune montajının kalitesini stereo mikroskop altında değerlendirin.NOT: Başarıyla monte edilmiş germ hatları, kapak kaymasına göre fark edilebilir bir hareket olmadan sabit bir şekilde tutturulmuştur. Kötü bağlanmış germ çizgileri tampon çözeltisinde çırpınacaktır. 5. Görüntüleme Tek moleküllü lokalizasyon mikroskobuNOT: Görüntüler, daha önce bildirildiği gibi, özel bir cisim etrafında inşa edilmiş özel yapım tek moleküllü bir lokalizasyon mikroskobu kullanılarak EMBL Görüntüleme Merkezi’nde elde edilmiştir.38,43, ‘de belirtilen benzersiz özelliklere sahip Malzeme Tablosu; https://www.embl.org/about/info/imaging-centre’ye bakınız3D boncuk kalibrasyonu edinmeDaha önce açıklandığı gibi yapışkan 100 nm floresan boncuklarla hassas bir kapak kayması (24 mm çap; 0,17 ± 0,005 mm, No. 1,5) hazırlayın38,44. Adım 5.1.1.1’den itibaren kalibrasyon numunesini bir numune tutucuya yerleştirin. Temiz 100x/1,5 yağ hedefine bir damla daldırma yağı ekleyin ve kalibrasyon numunesini mikroskopa monte edin. MicroManager 2 45,46 içinde, kalibrasyon numunesinde15-20 konum belirtin. EMU eklentisi penceresi47’de, adım 5.1.1.5’teki pozisyonların her biri için bir z-stack görüntüsünün alınmasını ayarlayın.NOT: Burada, bileşik silindirik bir lens, 3D görüntüleme için gereken astigmatizmayı sağlar ve 10 nm’lik bir artışla -1 μm ila 1 μm arasındaki aralığı kapsayan her bir pozisyon için 201 z-dilimi elde edilmiştir. Her z-dilimi için25 ms için 2 kW/cm2 640 nm lazer aydınlatma kullanılmıştır. Adım 5.1.11’de örnek görüntüler elde etmek için kullanılacak aynı optik yoldan 100 nm floresan boncukların z-stack görüntülerini elde edin. Süper çözünürlüklü mikroskopi analiz platformunu (SMAP48) kullanarak, adım 5.1.13’teki 3D-SMLM verilerine uymak için kullanılacak deneysel nokta yayılma fonksiyonunun (PSF) bir cspline modelini oluşturun. Numune tutucuyu hazırlayın. Burada kullanılan, görüntüleme odasını oluşturmak için manyetik bir halka kullanan özel yapım tutucu için (Şekil 2B), manyetik halkayı parafilm ile sarın.NOT: Alternatif olarak, içbükey çöküntü boşluğuna sahip bir mikroskop slaydı, slayt tutuculu mikroskoplar için numuneleri monte etmek için kullanılabilir. 1 mL görüntüleme tamponu44 hazırlayın (Tablo 1). Adım 4.2.6’dan bir kapak kapağı alın ve ısmarlama tutucuya yerleştirin. Tutucudaki kapak kaymasını parafilm sarılı manyetik halka ile sabitleyin (adım 5.1.2). Numunenin üstündeki manyetik halka tarafından oluşturulan hazneye görüntüleme tamponunu (adım 5.1.3) nazikçe pipetleyin (Şekil 2B). Odayı bir parça parafilm ile kapatın. Numuneyi monte etmek için, temiz 100x/1,5 yağ hedefine bir damla daldırma yağı ekleyin. Daldırma yağına herhangi bir hava sokmadan, numune tutucuyu monte edilmiş numuneyle (adım 5.1.5) mikroskop aşamasına yavaşça yerleştirin.NOT: Numuneyi mikroskopa yerleştirmeden önce, kapak kapağının tabanını doku ve% 70 etanol ile temizleyin. MicroManager 245,46 içindeki EMU eklenti penceresi47’yi kullanarak, kadran fotodiyotunda (QPD) odak kilidi lazerinden gelen sinyal algılanana kadar piezo aşamasını hareket ettirin.NOT: Görüntüleme süresi boyunca sabit bir odağı korumak için, odak kilitleme, yakın kızılötesi fiber bağlantılı bir lazerin kapak kaymasından toplam dahili yansıması ve ardından bir kadran fotodiyot (QPD) üzerinde yüksekliğe duyarlı algılama ile elde edilir. QPD sinyali, objektif lens piezo yuvasının kapalı döngü kontrolünü sağladı. Daldırma yağında hava kabarcıklarının olmadığını doğrulamak için düşük güçte (yani% 1-5) 640 nm uyarma lazeri ile bir arka odak düzlemi görüntüsü elde edin.NOT: Bir hava kabarcığı algılanırsa numuneyi sahne alanından çıkarın. Kapak fişinin alt kısmını ve hedefi temizleyin ve 5.1.6-5.1.8 adımlarını tekrarlayın. Aksi takdirde, DAÜ yazılımı47’deki odağı kilitlemeye devam edin. Parlak alan aydınlatmasını kullanarak gonad dokusunu lokalize edin. Düşük yoğunluklu 640 nm aydınlatma kullanarak, dokunun birçok SC gerilmesini içeren bölümüne odaklanın.NOT: Kapak kaymasından 2 μm’den daha uzak olan yapılara odaklanmayın. Numuneyi bulmak için daha yüksek bir lazer gücü kullanmayın, çünkü bu bazı floroforları erken yanıp sönen bir duruma dönüştürebilir. Burada, 1.000’e ayarlanmış bir darbe ile yükselen modda 1 kW /cm2 kullanıldı. Uygun bir yanıp sönme hızı elde edilene kadar numuneyi ~30 s boyunca yüksek ışımada (27 kW /cm2) 640 nm aydınlatma ile pozlamaya devam edin (Ek Video 1). MicroManager 245,46’daki çok boyutlu alma aracını kullanarak 20 ms pozlama süresiyle 200.000 kare elde edin. Bu arada, istenen yanıp sönme hızını korumak için EMU eklentisi 38,47’nin etkinleştirme seçeneğini kullanarak UV aktivasyonunu ayarlayın.NOT: UV lazeri, maksimum darbe uzunluğu 10.000 olarak ayarlanmış şekilde yükselen modda 3 kW/cm2 parlaklıkta kullanın. SMLM görüntü rekonstrüksiyonu ve postprocessing gerçekleştirin.NOT: Ham SMLM verilerinden görüntüleri yeniden oluşturmak için, yayımlanmış yöntemlere bakın. Burada sunulan veriler SMAP48,49 yazılımı kullanılarak işlenmiştir. SMAP48 yazılımında süper çözümlenmiş görüntü yeniden yapılandırma, kanal atama, sapma düzeltme ve yerelleştirmelerin zayıf yerelleştirme hassasiyeti ve maksimum olasılık filtresiyle filtrelenmesi gerçekleştirildi. Uyarılmış emisyon tükenme mikroskobuNOT: Görüntüler, beyaz ışık lazeri, 775 nm darbeli STED lazer ve EMBL Görüntüleme Merkezi’ndeki (https://www.embl.org/about/info/imaging-centre) FALCON Fluorescence Lifetime IMyaşlanma modülü (Malzeme Tablosu) ile donatılmış entegre STED mikroskobik sistemde elde edilmiştir.Bir mikroskop slaytına 20 μL’lik bir damla montaj ortamı (Malzeme Tablosu) yerleştirin. Adım 4.2.2’den bir kapak kayması alın ve numuneyi montaj ortamına bakan kızağa yavaşça yerleştirin (Şekil 2B).NOT: Montaj ortamının içine hava cepleri sokmaktan kaçının. Montaj ortamının gece boyunca sertleşmesine izin verin.NOT: Numuneleri ertesi gün görüntüleyin veya görüntülemeye kadar 4 °C’de tutun. Numuneyi monte etmek için, 5.2.2 adımından numunenin kapak kapağına bir damla daldırma yağı ekleyin. 100x/1.40 yağ hedefi kullanarak numuneyi yavaşça mikroskop aşamasına yerleştirin. Numuneye odaklanın ve parlak alan aydınlatmasını kullanarak germline dokusunu bulun. Mikroskop yazılımını kullanarak, TauSTED görüntüsünün elde edileceği ilgi alanını belirtin. Numunede kullanılan floroforları uyarmak için kullanılan uyarma lazerlerini ve uygun güçlerini seçin.NOT: Burada, AlexaFluor 594-konjuge F(ab’)2 sekonder antikor fragmanlarını ve STAR 635P-konjuge F(ab’)2 parçalarını görüntülemek için %3 güçte 635 nm %4 güçte 580 nm lazer kullanılmıştır. Mikroskop yazılımını kullanarak, uygun bir STED tükenme lazer gücü seçin ve görüntü algılamayı ayarlayın.NOT: Burada, 775 nm STED tükenme lazer gücü% 40 olarak ayarlanmıştır. Dedektör, foton algılama için 10 kazanç değerine sahip, 100 Hz tarama hızıyla ve 17 nm piksel boyutunda sayım modunda kullanıldı. TauSTED edinimi için dört satırlı birikim kullanılmıştır.

Representative Results

SMLM ile C. elegans germline dokusu içindeki SC’yi görüntülemek için, kromozom eksenlerinin bir bileşeni olan HTP-3’ü ve enine filament SYP-5’in C-terminusunu bir hemaglutinin (HA) etiketi ile endojen olarak etiketlenmiş olarak lokalize etmek için 2 renk oranmetrik 3D-SMLM kullandık. Her iki proteinin de C. elegans’ın SC’si içindeki yeri daha önce diğer çalışmalarla16,30 olarak belirlenmişti. Kalın biyolojik örneklerde bulunan ışık saçılımını ve optik sapmaları en aza indirmek için, SC’leri içeren mayotik çekirdeklerin en alttaki z bölümünü görüntüledik (Şekil 3, sarı çizgiler). Elde edilen her görüntü için, görüntüleme düzleminin piezo sahne konumu, hedef kapak kaymasına odaklandığında piezo sahne konumuna göre işaretlendi. Bu, piezo mesafesinin kapak fişinden hesaplanmasına izin verdi. Başarılı bir şekilde monte edilmiş numuneler, kapak kaymasına yakın bir yere istikrarlı bir şekilde tutturulur ve gonad şeklini korur (yani, postfiksasyon adımı sırasında doku iki kapak kayması arasında ezilmez). Numune montajının kalitesi stereo mikroskop altında kolayca değerlendirilebilir, çünkü iyi tutturulmuş gonadlar çözeltide herhangi bir hareket göstermez (adım 4.2.6). Bununla birlikte, montaj işleminin stokastikliği nedeniyle, gonad dokusu mutlaka kapak kayması üzerine tamamen düz bir şekilde yerleştirilmeyecektir. Bu nedenle, SC’leri içeren çekirdeklerin alt düzlemi, aynı gonad içindeki örtü kaymasına göre değişen mesafelerde bulunabilir. Dokunun kapak kaymasına bağlanmasına bağlı olarak çözünürlüğün nasıl değiştiğini göstermek için, kapak kaymasına farklı piezo mesafelerinde görüntüler elde ettik. Tek bir görüntünün kalitesini değerlendirmek için, Fourier halka korelasyon (FRC) eğrileri50,51 hesaplandı ve çözünürlük, SMAP yazılımı48 içindeki FRCResolution eklentisi kullanılarak belirlendi. Kapak kaymasına farklı mesafelerde çekilen iki ayrı 3D-SMLM görüntüsünden çıkarılan iki temsili çekirdek Şekil 4’te gösterilmiştir. Örtü kaymasının yakınında bulunan SC’lerde, kromozom eksenleri ve SYP-5::HA’nın C-terminusu her üç boyutta da iyi bir şekilde çözülmüştür (Şekil 4A, kapak kaymasından 0.8 μm). Belirli bir mesafe ile ayrılmış iki yapıyı çözmek için, elde edilen FRC çözünürlüğü genellikle eksenel çözünürlükte bu mesafenin yarısından daha küçük olmalıdır. Aynı yapıları yanal olarak ayırmak için, daha küçük FRC çözünürlük değerlerinin elde edilmesi gerekir. Gerçekten de, kapak fişine yakın bir yerde bulunan örneklerde, FRC çözünürlüğü AlexaFluor 647 kanalı için 38 nm ve CF680 kanalı için 34 nm’dir ve bu nedenle SYP-516’nın C-termini arasındaki beklenen 84 nm mesafenin çok altındadır. Bu nedenle bu karar, SC’nin organizasyonunu sadece cephede değil, aynı zamanda yanal görüşlerde de kolayca çözmektedir (Şekil 4B i,ii). Buna karşılık, ışık saçılması ve küresel sapmalar nedeniyle kapak kaymasından 5 μm mesafede bulunan SC’lerde çözünürlük bozulur (Şekil 4B). Bu mesafedeki FRC çözünürlükleri, SYP-5’in C-terminini tam olarak çözemeyen 47 nm (AlexaFluor 647) ve 41 nm’ye (CF680) düşer. Optik sapmalar yanal çözünürlüğü eksenel çözünürlükten daha ciddi şekilde bozduğundan, HTP-3 ve SYP-5 bantları artık kapak kaymasından 5 μm mesafede bulunan örneklerde yanal görünümün kesitinde net bir şekilde çözülmemektedir (Şekil 4B ii). Kapak kaymasından farklı piezo mesafelerinde elde edilen görüntülerin FRC çözünürlüğünün karşılaştırılması, görüntülenen dokunun kapak kaymasından 2 μm’den daha fazla olmaması gerektiğini ortaya koymuştur (Şekil 5). Bu sonuç, postfiksasyon adımının doğru bir şekilde uygulanmasının önemini vurgulamaktadır, bu sırada doku, kapak kaymasının poli-L-lizin kaplamasına başarılı bir şekilde çapraz bağlanmalıdır. Başka bir süper çözünürlük tekniği ile elde edilebilir çözünürlüğü göstermek için, SC’leri TauSTED mikroskobu ile sabit bozulmamış germline dokusunda da görüntüledik. Şekil 6A, SC’nin önden görünümdeki çizgi profillerinden tahmin edildiği gibi, bu çalışmada elde edilen en yüksek ve en düşük çözünürlüğe sahip TauSTED görüntülerini göstermektedir (Şekil 6B). Her iki çekirdekte de, kromozom eksenlerinde HTP-3’ün iki lokalizasyon bandını ve merkezi bölgedeki SYP-5’in C-terminini çözebiliriz, bu da TauSTED’de bu optimize edilmiş protokolü kullanarak elde edilebilecek çözünürlüğün 84 nm’nin altında olduğunu göstermiştir. En uygun koşullar altında (Şekil 6A, üstte), C-termini SC’nin sadece 50 nm ile ayrılmış hafif eğimli görünümlerinde çözebiliriz (Şekil 6A, sarı dikdörtgen ve 6C). Şekil 1: Caenorhabditis elegans’taki sinaptonemal kompleksin organizasyonunun şeması. Karikatür, C. elegans’taki SC’nin basitleştirilmiş bir yapısını, iki homolog kromozomu (gri) birbirine bağlayan bir yapıyı göstermektedir. Yapı ön, yanal ve kesitsel görünümlerde gösterilir. Kromozom eksenleri kırmızı çubuklar olarak görüntülenirken, enine filamentler camgöbeği içinde gösterilir. Enine filament proteinleri (C. elegans’ta SYP-1, 5, 6), iki eksen arasındaki mesafeyi köprülemek için merkezi bölgede kafa kafaya bir şekilde (camgöbeği bilyalı çubuk grafikleri) yönlendirilir. Eksenler ve enine filamentlerin C-termini arasındaki beklenen mesafeler belirtilmiştir. Kısaltma: SC = synaptonemal complex. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Çalışmada kullanılan örnek preparatın illüstrasyonu . (A) Genç C. elegans yetişkinleri başlarına veya kuyruklarına (yeşil, kesikli çizgiler) diseke edilir ve protokolde açıklandığı gibi işlenir. (B) Yöntemin bireysel adımları, gri oklarla bağlanmış grafiklerle gösterilir. Kısaltmalar: STED = uyarılmış emisyon tükenmesi; SMLM = tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu; PBS = fosfat tamponlu salin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu ile gözlenebilen doku kesitinin yeri. Bütün bir montaj C. elegans gonadının dönen disk konfokal görüntüsünün MIP’si. Doku HTP-3 ve SYP-5’in C-terminali (SYP-5::HA) için boyandı ve kombine sinyal gri renkte gösterildi. Bireysel konfokal görüntüler, tüm gonadın bir görüntüsünü oluşturmak için Izgara / Koleksiyon dikiş Fiji eklentisi52 kullanılarak dikildi. İç kısım, SC’leri içeren en alttaki z-düzleminin xy görünümünü gösterir. Bu düzlemin lokalizasyonu, gonadın MIP görüntüsünde bir dikdörtgenle gösterilen doku bölümünün ortogonal görünümlerinde gösterilir (sarı çizgiler). Ölçek çubukları = 10 μm. Kısaltmalar: MIP = maksimum yoğunluk projeksiyonu; SC’ler = sinaptonemal kompleksler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: HTP-3’ün tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu ve SYP-5’in C-termini. (A,B) Sol: HTP-3 (kırmızı) için boyanmış pakiten çekirdeklerini gösteren SMLM görüntüleri ve SYP-5’in C-terminusu (SYP-5::HA, camgöbeği) (ölçek çubuğu = 1 μm). Orta: A ve B’de belirtilen, her görüntünün altında karşılık gelen kesit görünümleriyle birlikte gösterilen ilgi çekici bölgelerin yakınlaştırılmış görüntüleri (i, ii; ölçek çubuğu = 100 nm). SC’nin yakınlaştırılmış görüntülerdeki uzantıları, kromozom eksenlerini y eksenine paralel olarak yönlendirmek için döndürülür. Sağ: SC içindeki ilgili proteinlerin lokalizasyonunun grafiksel gösterimi, SC’nin şeklin merkezinde görüntülenen yakınlaştırılmış bölgelerdeki yönelimini tasvir eder. Kısaltmalar: SMLM = tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi; SC = sinaptonemal kompleks. SMLM görüntülerini yeniden oluşturmak için ham veriler BioStudies veritabanı60 (Katılım Kimliği: S-BIAD504) aracılığıyla kullanılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi görüntülerinin Fourier halka korelasyon çözünürlüğü, görüntülenen z-düzleminin kapak kayması düzleminden uzaklığına bağlıdır. Renkli çizgiler, kapak kapağından farklı mesafelerde (renk çubuğuyla gösterildiği gibi) elde edilen görüntülerin FRC eğrilerini gösterir. FRC çözünürlüğünü belirlemek için kullanılan 1/7 eşiği siyah yatay bir çizgi ile gösterilir. Girintiler, FRC çözünürlüğünün kapak fişinden piezo mesafesine bağımlılığını gösterir. Çizim, orijinal eğrilerin “ggplot2” paketindeki işlevlerle düzgünleştirildiği özel olarak yazılmış bir R komut dosyası (sürüm 4.1.2, Ek Dosya 1) tarafından gerçekleştirildi. Kısaltmalar: FRC = Fourier halka korelasyonu; SMLM = tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu; SC = sinaptonemal kompleks. FRC eğrileri ve SMLM verileri BioStudies veritabanı60 (Katılım Kimliği: S-BIAD504) aracılığıyla edinilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Floresan ömür boyu tabanlı bilgi (TauSTED) ile geliştirilmiş uyarılmış emisyon tükenme mikroskobu, hem HTP-3 hem de SYP-5’in C-terminusu için iki lokalizasyon bandını çözer. (A) İki temsili TauSTED görüntüsü, HTP-3 (kırmızı) ve SYP-5’in C-terminusu (SYP-5::HA, camgöbeği) için boyanmış pakiten çekirdeklerini, daha yüksek (üst) ve alt (alt) yapısal tanım (ölçek çubuğu = 1 μm) ile göstermektedir. Dikdörtgenler, SYP-5’in çözülmüş C-termini ile bölgeleri önden (beyaz) ve SC’nin hafif eğimli bir görünümü (sarı) ile işaretler. (B, C) HTP-3 (kırmızı) dağılımı ve TauSTED tarafından çözülen SYP-5 (camgöbeği) sinyalinin C-terminusu. SC’yi önden (B) veya hafif eğimli (C) görünümlerde içeren ilgili bölgelerin çizgi profilleri, yoğunluğu maksimum değere normalleştirilmiş tam çizgiler olarak gösterilir. Çizgi profilleri Fiji ImageJ kullanılarak oluşturulmuştur. B’deki kesikli çizgiler , her protein için ortalama verileri gösterir. C’deki kalın camgöbeği çizgisi , SYP-5’in C-termini arasındaki en kısa çözülmüş mesafeye sahip çizgi profiline karşılık gelir. Spesifik proteinleri hedef alan antikorlar arasındaki mesafeleri belirlemek için, çizgi profilleri (n = 9 (B), n = 7 (C)), özel olarak yazılmış bir R betiği (sürüm 4.1.2, Ek Dosya 1) kullanılarak çift gaussianlar ile donatıldı. Ortalama mesafe ± standart sapma (B) ve minimum değeri kalın (C) olarak vurgulanan aralık sırasıyla her grafiğin üstünde gösterilir. Kısaltmalar: STED = uyarılmış emisyon tükenme mikroskobu; SC = sinaptonemal kompleks. Çizilen çizgi profillerinin görüntülenen görüntüleri ve veri noktaları BioStudies veritabanı60 (Katılım Kimliği: S-BIAD504) aracılığıyla kullanılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Tablo 1: Bu protokolde kullanılan tamponların ve çözeltilerin bileşimi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Video 1: Tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi edinimi. Floroforların uygun bir hızda yanıp söndüğünü gösteren video (50 kare gösterilir, ölçek çubuğu = 5 μm, 20 ms/kare). Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Dosya 1: Veri analizi komut dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Homolog kromozomların doğru rekombinasyonu ve ayrışması için gerekli olan SC’nin merdiven benzeri organizasyonu, ilk olarak yaklaşık 70 yıl önce elektron mikroskobu 3,4’te gözlemlenmiştir. SC’nin genel organizasyonu elektron mikroskobunda kolayca çözülürken, bu kompleks içindeki bireysel bileşenlerin lokalizasyonu daha hedefli bir yaklaşım gerektirir. Sadece ~ 100 nm genişliğiyle, SC’nin alt yapısı geleneksel floresan mikroskobu ile çözülemez. Bununla birlikte, süper çözünürlüklü mikroskopi, sinaptonemal kompleksin yapısı ve işlevi üzerine yeni keşifler için önemli bir itici güç haline gelmiştir 16,19,24,25,26,27,28,29,30. Bu araştırmayı kolaylaştırmak için, SMLM ve STED mikroskobu ile C. elegans gonad dokusu içindeki SC’nin mimarisini incelemeye izin veren bir montaj prosedürü gösterdik.

SMLM görüntülemede çözünürlüğü optimize etmek için kritik bir adım, germ hattı dokusunu poli-L-lizin kaplı bir kapak kaymasına doğrudan çapraz bağlamaktır (adım 4). Dokunun kapak kaymasına kovalent olarak bağlanması, numune içindeki hareketleri azaltmak ve SMLM için uzun süre görüntülemeyi imkansız hale getirecek şekilde büyük sapmalara neden olacak şekilde gereklidir. Ek olarak, SC’leri içeren çekirdekleri kapak kaymasından uzakta bırakan optimal olmayan bir bağlantı bile, küresel sapmalardan kaynaklanan ulaşılabilir çözünürlükte önemli bir düşüşe yol açar (Şekil 4). Burada kullanılan kovalent ataşmana alternatif olarak, lekeli germline dokusu, küçük bir görüntüleme tamponu19,30 damlasında iki kapalı kapak kapağı arasında hareketsiz hale getirilebilir. Bununla birlikte, bu immobilizasyon yöntemi, numunedeki görüntüleme tamponunun hacmini, burada optimize edilmiş protokolde kullanılan 1 mL’den sadece birkaç μL’ye düşürür, bu da görüntüleme tamponunun asitlenmesine neden olur ve numunenin görüntülenebileceği süreyi ciddi şekilde azaltır 38,53,54.

Hem SMLM hem de STED mikroskopisi için uzun elde etme süreleri, bu yöntemlerin kullanımını kimyasal olarak sabitlenmiş numunelerin görüntülenmesiyle sınırlar. Burada, paraformaldehit fiksasyonu, numune hazırlama ve görüntüleme sırasında SC’nin yapısının korunmasını sağlar. Bununla birlikte, SC’yi sağlam doku içinde görüntülemek için burada alınan önlemlere rağmen, fiksasyondan sonra SC’nin ortaya çıkan yapısı, canlı bir organizma içindeki doğal durumundaki yapıyla aynı olmak zorunda değildir. Dahası, sabit SC’nin tek bir görüntüsü biyolojik yapının tek bir “anlık görüntüsünü” temsil ettiğinden, bu yaklaşım in vivo olarak doğal yapının dinamiklerine kör kalır.

Bununla birlikte, makromoleküler yapıların dinamikleri ve değişkenliği hakkında bilgi, sadece tek bir değil, birçok “anlık görüntü” elde edilerek de elde edilebilir. Bu yaklaşım, pachytene19 sırasında SC’nin yapısındaki değişiklikleri çözebilirken, bu protokol kullanılarak hazırlanan tek bir örneklemden elde edilebilecek görüntü sayısını sınırlayan birkaç faktör vardır. İlk olarak, görüntü elde etme sırasında kullanılan yüksek lazer güçleri, floroforların kalıcı olarak ağartılmasına yol açar ve bitişik ilgi alanlarının veya çoklu z-düzlemlerinin görüntülenmesini engeller, böylece tek bir numuneden elde edilebilecek görüntü sayısını önemli ölçüde azaltır. İkincisi, bu yöntemle hazırlanan kapak kayması üzerindeki numune/doku yoğunluğu düşüktür, bu da tek bir kapak kaymasından elde edilebilecek görüntü sayısını önemli ölçüde sınırlar. Düşük numune yoğunluğu,diğer biyolojik sorulara ışık tutmaya yardımcı olan otomatik görüntü toplama boru hatlarının kullanımını da yasaklar 34,55,56,57,58,59. Bununla birlikte, numune yoğunluğu deneyimli bir kullanıcı tarafından biraz arttırılabilir.

Burada sunulan protokol, SMLM35’te optimum çözünürlük elde etmek için gerekli olan yüksek etiketleme yoğunluğunu elde etmek için optimize edilmiştir. Önceki protokoller, immün boyama16’dan önce dokuyu kovalent olarak kapak kaymasına bağlarken, bu yeni protokol, dokuyu yalnızca numuneler çözelti içinde boyandıktan sonra kapak kaymasına çapraz bağlar. Bu modifikasyon, immünoetiketleme için kullanılan antikorların dokuya her taraftan serbestçe erişmesine izin verirken, dokunun kapak kaymasına kovalent bağlanması, antikorların kapak kaymasına en yakın çekirdeğe ulaşmasını kısıtlayabilir ve böylece etiketleme derecesini azaltabilir. Birlikte, burada açıklanan modifikasyonlar çözünürlüğü 40-50 nm’den (FRC çözünürlüğü)16’dan 30-40 nm’ye (bu protokol) yükseltir.

Önemli olarak, SMLM için yüksek etiketleme yoğunluğu ve yüksek konsantrasyonda antikor gerekli olsa da, daha düşük antikor konsantrasyonları kullanılarak daha iyi STED mikroskopi görüntülerinin elde edildiğini bulduk. Onlarca nanometrelik bir çözünürlükte, ilgilenilen proteini etiketlemek için kullanılan moleküllerin boyutu giderek daha önemli hale geliyor. Bu nedenle, tam uzunluktaki antikorların yarısı büyüklüğünde olan F (ab’)2 fragmanlarını kullandık. Daha küçük bir sinyal kaynağı nedeniyle lokal kontrasttaki iyileşme ve dolayısıyla tam uzunlukta ikincil antikorların kullanılmasına kıyasla bu modifikasyonla elde edilen çözünürlük, merkezi bölge içindeki SYP-5’in iki C-termininin TauSTED tarafından çözülmesine izin verdi, bunlar tam uzunlukta antikorlar kullanılarak geleneksel STED ile çözülmedi (16 ve veriler gösterilmedi). Bozulmamış C. elegangerm hatlarındaki SC’leri görüntülemek için optimize edilmiş bu protokolün, mayoz sırasında SC’nin yapı-fonksiyon ilişkisinin araştırılmasını kolaylaştıracağını tahmin ediyoruz.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Jonas Ries’e ve Ries laboratuvarına SMLM görüntüleme için görüntüleme tamponlarını paylaştıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca bu protokolde kullanılan C. elegans suşu için Yumi Kim’e ve tavuk-anti-HTP-3 antikoru için Abby F. Dernburg’a teşekkür ederiz. EMBL Heidelberg’deki Gelişmiş Işık Mikroskobu Tesisi’nden Marko Lampe ve Stefan Terjung’a Olympus iXplore SPIN SR konfokal mikroskopu kullanımındaki destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı – 452616889, SK) tarafından desteklenmiştir. Boehringer Ingelheim Vakfı tarafından cömertçe desteklenen Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı (EMBL IC) Görüntüleme Merkezi tarafından sağlanan erişim ve hizmetleri kabul ediyoruz.

Materials

100x/1.5 oil objective Olympus UPLAPO100XOHR UPLAPO100XOHR
2-mercaptoethylamine (MEA) Sigma-Aldrich 30070-10G Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH  8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 °C.
Additional 640 nm booster laser Toptica IBEAM-SMART-640-S-HP
AlexaFluor 594, NHS ester ThermoFischer Scientific A37572 Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
AlexaFluor 647, NHS ester ThermoFischer Scientific A37573 Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
anti-HA Thermo Fisher Scientific 2-2.2.14 Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
anti-HTP-3 a gift from Abby F. Dernburg MacQueen et al., 2005 Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
Caenorhabditis elegans strain  YKM349 a gift from Yumi Kim Hurlock et al., 2020 syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II
CF6680, NHS ester Biotium 92139 Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
Circular cover glass 12 mm No. 1 Menzel-Gläser; VWR 631-0713
Circular cover glass 24 mm No. 1.5 Carl Roth PK26.1
Cylindrical lenses Thorlabs LJ1516RM-A, LK1002RM-A
Egg Buffer (10x) Edgar 1995 250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4
Ethanol (absolute for analysis) Merck 64-17-5
F(ab’)2 fragment anti-chicken IgY Jackson Immunoresearch AB_2340347 Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
F(ab’)2 fragment anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch AB_2340761 Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy)
Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick Fisher scientific 7107
Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm – Iridium 10% Kisker 789265
Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat ) a gift from Jonas Ries Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155),
50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 °C.
Imaging buffer base a gift from Jonas Ries Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose.
Aliquoted to a single-use volume (950 μL), frozen, and kept at -80 °C.
Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant ThermoFischer Scientific P36982
Leica Stellaris 8 STED FALCON Leica N/A The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample.  Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut.
Longwave channel emission filter AHF Analysentechnik F47-702 700/100 nm bandpass
Methanol (absolute for analysis) Merck 67-56-1
NaHCO3 Sigma-Aldrich/Merck S5761-500G 100 mM NaHCO3, pH 8.3
Near-infrared fiber-coupled laser Toptica IBEAM-SMART-PT-CD Custom Design, 808 nm – 75mW
Objective lens piezo mount (PIFOC ) Physik Instrumente P-726.1.CD 100 µm travel range
Orca Fusion BT sCMOS camera Hamamatsu C15440-20UP
PCR tubes Greiner Bio-One 673283 0.2 mL
Phosphate Saline Buffer (PBS 10x) N/A 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4
Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free ThermoFischer Scientific 28906 16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature.
PlasmaPrep2 plasma cleaner GaLa Instrumente GmbH N/A
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich/Merck P2636-25MG 0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 °C.
Primary dichroic (illumination reflecting) AHF Analysentechnik F73-866S quad bandpass @ 405, 488, 561, 640
Quadnotch filter AHF Analysentechnik F40-072 405/488/561/640 nm
Quadrant photodiode (QPD) Laser Components SD197-23-21-041, LC301DQD-PV
Razor blades Apollo Herkenrath Solinger N/A
Refractive beam shaper AdlOptica PiShaper 6_6_VIS
Roche Blocking Reagent Roche 11096176001 10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 °C.
Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3) Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH 1110911
Scalpel removal box Fisher scientific 10002-50
Secondary dichroic (emission reflecting) AHF Analysentechnik F38-785S 750 nm longpass
Shortpass filter Semrock BSP01-785R-25  750 nm
Shortwave channel emission filter AHF Analysentechnik F37-677  676/37 nm bandpass
Single molecule localization microscope EMBL Imaging Centre Diekmann et al., 2020 with modifications The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera  and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm.
For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking).
A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging.
To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 – 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser  from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount.
For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de
Single-mode fiber-coupled multi-laser engine Toptica iCHROME MLE-LFA-HP Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm
Splitting dichroic AHF Analysentechnik F48-665SG 665 nm long pass
Square cover glass 22 x 22 mm No.1 Menzel-Gläser; VWR 630-2882
STAR 635P, NHS ester Abberior ST635P-0002-1MG Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C
Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB Zeiss N/A
Tetramisole hydrochloride Sigma-Aldrich/Merck T1512-2G 1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 °C.
Thawed aliquot was kept at 4 °C and used for several months.
TetraSpeck Microspheres ThermoFischer Scientific T7279  0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red
Tris Saline Buffer (TBS 10x) N/A 200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5
TWEEN 20 Sigma-Aldrich/Merck P9416-50ML Kept at room temperature in original packaging.
WormStuff worm pick Kisker 789277
XY microscope stage  Smaract N/A Custom Design
Zeba Micro Spin Desalting Column ThermoFischer Scientific 89877  7K MWCO, 75 µL
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zickler, D., Kleckner, N. Meiotic chromosomes: integrating structure and function. Annual Review of Genetics. 33, 603 (1999).
  2. Ur, S. N., Corbett, K. D. Architecture and dynamics of meiotic chromosomes. Annual Review of Genetics. 55, 497-526 (2021).
  3. Fawcett, D. W. The fine structure ot chromosomes in the meiotic prophase of vertebrate spermatocytes. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2 (4), 403-406 (1956).
  4. Moses, M. J. Chromosomal structures in crayfish spermatocytes. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2 (2), 215-218 (1956).
  5. Hillers, K. J., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. L. Meiosis. WormBook. , 433-434 (2017).
  6. Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes & Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
  7. Severson, A. F., Ling, L., Van Zuylen, V., Meyer, B. J. The axial element protein HTP-3 promotes cohesin loading and meiotic axis assembly in C. elegans to implement the meiotic program of chromosome segregation. Genes & Development. 23 (15), 1763-1778 (2009).
  8. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Müller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & Development. 13 (17), 2258-2270 (1999).
  9. Martinez-Perez, E. HTP-1-dependent constraints coordinate homolog pairing and synapsis and promote chiasma formation during C. elegans meiosis. Genes & Development. 19 (22), 2727-2743 (2005).
  10. Couteau, F., Zetka, M. HTP-1 coordinates synaptonemal complex assembly with homolog alignment during meiosis in C. elegans. Genes & Development. 19 (22), 2744-2756 (2005).
  11. Goodyer, W., et al. HTP-3 Links DSB Formation with Homolog Pairing and Crossing Over during C. elegans Meiosis. Developmental Cell. 14 (2), 263-274 (2008).
  12. Colaiácovo, M. P., et al. Synaptonemal complex assembly in C. elegans is dispensable for loading strand-exchange proteins but critical for proper completion of recombination. Developmental Cell. 5 (3), 463-474 (2003).
  13. MacQueen, A. J., Colaiácovo, M. P., McDonald, K., Villeneuve, A. M. Synapsis-dependent and -independent mechanisms stabilize homolog pairing during meiotic prophase in C. elegans. Genes & Development. 16 (18), 2428-2442 (2002).
  14. Smolikov, S., et al. Synapsis-defective mutants reveal a correlation between chromosome conformation and the mode of double-strand break repair during Caenorhabditis elegans meiosis. Genetics. 176 (4), 2027-2033 (2007).
  15. Smolikov, S., Schild-Prüfert, K., Colaiácovo, M. P. A yeast two-hybrid screen for SYP-3 interactors identifies SYP-4, a component required for synaptonemal complex assembly and chiasma formation in Caenorhabditis elegans meiosis. PLoS Genetics. 5 (10), 1000669 (2009).
  16. Hurlock, M. E., et al. Identification of novel synaptonemal complex components in C. Elegants. The Journal of Cell Biology. 219 (5), (2020).
  17. Zhang, Z., et al. Multivalent weak interactions between assembly units drive synaptonemal complex formation. The Journal of Cell Biology. 219 (5), (2020).
  18. Schild-Prüfert, K., et al. Organization of the synaptonemal complex during meiosis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 189 (2), 411-421 (2011).
  19. Köhler, S., Wojcik, M., Xu, K., Dernburg, A. F. The interaction of crossover formation and the dynamic architecture of the synaptonemal complex during meiosis. bioRxiv. , (2020).
  20. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6621), 543-548 (2015).
  21. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  22. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  23. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  24. Schücker, K., Holm, T., Franke, C., Sauer, M., Benavente, R. Elucidation of synaptonemal complex organization by super-resolution imaging with isotropic resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (7), 2029-2033 (2015).
  25. Cahoon, C. K., et al. Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 6857-6866 (2017).
  26. Zwettler, F. U., et al. Tracking down the molecular architecture of the synaptonemal complex by expansion microscopy. Nature Communications. 11 (1), 1-11 (2020).
  27. Yoon, S., Choi, E. H., Kim, J. W., Kim, K. P. Structured illumination microscopy imaging reveals localization of replication protein A between chromosome lateral elements during mammalian meiosis. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-12 (2018).
  28. Prakash, K., et al. Superresolution imaging reveals structurally distinct periodic patterns of chromatin along pachytene chromosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14635-14640 (2015).
  29. Xu, H., et al. Molecular organization of mammalian meiotic chromosome axis revealed by expansion STORM microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (37), 18423-18428 (2019).
  30. Köhler, S., Wojcik, M., Xu, K., Dernburg, A. F. Superresolution microscopy reveals the three-dimensional organization of meiotic chromosome axes in intact Caenorhabditis elegans tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (24), 4734-4743 (2017).
  31. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  32. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14271-14276 (2008).
  33. Jahr, W., Velicky, P., Danzl, J. G. Strategies to maximize performance in STimulated Emission Depletion (STED) nanoscopy of biological specimens. Methods. 174, 27-41 (2019).
  34. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  35. Xu, K., Shim, S. -. H., Zhuang, X. Super-resolution imaging through stochastic switching and localization of single molecules: an overview. Far-Field Optical Nanoscopy. , 27-64 (2013).
  36. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22 (13), 15982 (2014).
  37. Winterflood, C. M., Platonova, E., Albrecht, D., Ewers, H. Dual-color 3D superresolution microscopy by combined spectral-demixing and biplane imaging. Biophysical Journal. 109 (1), 3-6 (2015).
  38. Diekmann, R., et al. Optimizing imaging speed and excitation intensity for single molecule localization microscopy. Nature Methods. 17 (9), 909 (2020).
  39. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  40. Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 558, 171-195 (2009).
  41. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
  42. MacQueen, A. J., et al. Chromosome sites play dual roles to establish homologous synapsis during meiosis in C. elegans. Cell. 123 (6), 1037-1050 (2005).
  43. Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification. Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).
  44. Hoess, P., Mund, M., Reitberger, M., Ries, J. Dual-color and 3D super-resolution microscopy of multi-protein assemblies. Methods in Molecular Biology. 1764, 237-251 (2018).
  45. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer Control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).
  46. Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
  47. Deschamps, J., Ries, J. EMU: reconfigurable graphical user interfaces for Micro-Manager. BMC Bioinformatics. 21 (1), 1-13 (2020).
  48. Ries, J. SMAP: a modular super-resolution microscopy analysis platform for SMLM data. Nature Methods. 17 (9), 870-872 (2020).
  49. Li, Y., et al. Global fitting for high-accuracy multi-channel single-molecule localization. Nature Communications. 13 (1), 1-11 (2022).
  50. Nieuwenhuizen, R. P. J., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nature Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
  51. Banterle, N., Bui, K. H., Lemke, E. A., Beck, M. Fourier ring correlation as a resolution criterion for super-resolution microscopy. Journal of Structural Biology. 183 (3), 363-367 (2013).
  52. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  53. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  54. Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gönczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomedical Optics Express. 4 (6), 885-899 (2013).
  55. Mund, M., et al. Superresolution microscopy reveals partial preassembly and subsequent bending of the clathrin coat during endocytosis. bioRxiv. , (2022).
  56. Mund, M., et al. Systematic nanoscale analysis of endocytosis links efficient vesicle formation to patterned actin nucleation. Cell. 174 (4), 884-896 (2018).
  57. Sabinina, V. J., et al. Three-dimensional superresolution fluorescence microscopy maps the variable molecular architecture of the nuclear pore complex. Molecular Biology of the Cell. 32 (17), 1523-1533 (2021).
  58. Cieslinski, K., et al. Nanoscale structural organization and stoichiometry of the budding yeast kinetochore. bioRxiv. , (2021).
  59. Sieben, C., Banterle, N., Douglass, K. M., Gönczy, P., Manley, S. Multicolor single-particle reconstruction of protein complexes. Nature Methods. 15 (10), 777-780 (2018).
  60. Sarkans, U., et al. The BioStudies database—one stop shop for all data supporting a life sciences study. Nucleic Acids Research. 46, (2018).

Tags

Super-resolution MicroscopySynaptonemal ComplexCaenorhabditis ElegansGermlineMeiosisImmunostainingSingle Molecule Localization MicroscopyDissectionFixationAntibody Staining

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Čavka, I., Power, R. M., Walsh, D., Zimmermann, T., Köhler, S. Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline. J. Vis. Exp. (187), e64363, doi:10.3791/64363 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image