Difusión y ensamblaje de una sola molécula en membranas lipídicas llenas de polímeros
Summary
Aquí, se presenta un protocolo para realizar y analizar la unión, movilidad y ensamblaje de moléculas individuales en membranas lipídicas artificiales apiñadas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total de molécula única (smTIRF).
Abstract
Las membranas celulares son ambientes muy concurridos para las reacciones biomoleculares y la señalización. Sin embargo, la mayoría de los experimentos in vitro que investigan la interacción de proteínas con lípidos emplean membranas bicapa desnudas. Tales sistemas carecen de las complejidades del hacinamiento por proteínas y glicanos incrustados en la membrana y excluyen los efectos de volumen asociados encontrados en las superficies de la membrana celular. Además, la superficie de vidrio cargada negativamente sobre la que se forman las bicapas lipídicas impide la libre difusión de las biomoléculas transmembrana. Aquí, presentamos una membrana polimérico-lípida bien caracterizada como un imitador de membranas lipídicas abarrotadas. Este protocolo utiliza lípidos conjugados con polietilenglicol (PEG) como un enfoque generalizado para incorporar crowders en la bicapa lipídica soportada (SLB). En primer lugar, se presenta un procedimiento de limpieza de los portaobjetos microscópicos y cubreobjetos para realizar experimentos de una sola molécula. A continuación, se discuten los métodos para caracterizar los PEG-SLB y realizar experimentos de una sola molécula de unión, difusión y ensamblaje de biomoléculas utilizando el seguimiento de una sola molécula y el fotoblanqueo. Finalmente, este protocolo demuestra cómo monitorear el ensamblaje de nanoporos de la toxina formadora de poros bacteriana citolisina A (ClyA) en membranas lipídicas abarrotadas con análisis de fotoblanqueo de una sola molécula. También se incluyen códigos de MATLAB con datasets de ejemplo para realizar algunos de los análisis comunes, como el seguimiento de partículas, la extracción de comportamiento difusivo y el recuento de subunidades.
Introduction
Las membranas celulares son sistemas muy concurridos y complejos1. El hacinamiento molecular puede tener un impacto considerable en la difusión de entidades unidas a la membrana como proteínas y lípidos 2,3,4. Del mismo modo, las reacciones bimoleculares en las membranas lipídicas como la dimerización del receptor o la oligomerización de los complejos de membrana están influenciadas por el hacinamiento 5,6,7. La naturaleza, configuración y concentración de los crowders pueden gobernar la unión a la membrana, la difusividad y la interacción proteína-proteína de varias maneras 8,9. Dado que controlar el apiñamiento de la membrana en las membranas celulares e interpretar su influencia en las biomoléculas incrustadas es un desafío, los investigadores han tratado de establecer sistemas alternativos in vitro 10.
Un enfoque popular para las membranas artificiales apiñadas es dopar las membranas bicapa con lípidos injertados de polímero (como polietilenglicol, PEG)11,12. Durante la visualización de la dinámica de proteínas y lípidos en bicapas lipídicas soportadas (SLB), estos polímeros también protegen los componentes incrustados en la membrana del sustrato subyacente cargado negativamente (como el vidrio) al levantar efectivamente la bicapa lejos del soporte subyacente. Al variar el tamaño y la concentración del polímero, se puede controlar el grado de apiñamiento molecular, así como su separación del soporte sólido subyacente13,14. Esto es claramente una ventaja sobre las bicapas lipídicas soportadas sobre sustratos sólidos sin amortiguadores poliméricos15,16, donde las biomoléculas transmembrana pueden perder su actividad17,18,19. Más importante aún, nos permite recapitular el ambiente abarrotado de la membrana celular in vitro, que es crítico para muchos procesos de membrana.
Los polímeros injertados superficialmente en membranas también sufren cambios en su configuración dependiendo de su densidad de injerto12. A bajas concentraciones, permanecen en una configuración entrópicomente enrollada, conocida como hongo, por encima de la superficie de la membrana. Con el aumento de la concentración, comienzan a interactuar y tienden a desenrollarse y extenderse, produciendo finalmente una densa formación en forma de cepillo en la membrana21. Dado que la transición del régimen de hongo al régimen de cepillo es altamente heterogénea y se manifiesta en condiciones poco caracterizadas del polímero, es importante utilizar condiciones bien caracterizadas para el apiñamiento en membranas injertadas de polímero. En comparación con un estudio reciente20, identificamos e informamos composiciones de membrana abarrotadas que mantienen el transporte difusivo y la actividad de las biomoléculas transmembrana.
En este protocolo, discutimos cómo generar membranas lipídicas pegiladas y proporcionamos recomendaciones para densidades de PEG que imitan el hacinamiento en dos regímenes diferentes de configuración de polímeros (a saber, hongo y cepillo). El protocolo también describe la unión de moléculas individuales, el seguimiento de partículas y la adquisición y análisis de datos de fotoblanqueo para moléculas incrustadas en estas membranas abarrotadas. Primero, describimos los pasos de limpieza a fondo, el ensamblaje de la cámara de imágenes y la generación de PEG-SLB. En segundo lugar, proporcionamos detalles para los experimentos de unión de moléculas individuales, seguimiento de partículas y fotoblanqueo. En tercer lugar, discutimos i) extraer las afinidades de unión relativas, ii) caracterizar la difusión molecular, y iii) contar subunidades en un ensamblaje de proteínas a partir de películas de moléculas individuales en la membrana.
Si bien caracterizamos este sistema con imágenes de una sola molécula, el protocolo es útil para todos los biofísicos de membrana interesados en comprender el efecto del hacinamiento en las reacciones biomoleculares en las membranas lipídicas. En general, presentamos una sólida cartera para hacer bicapas lipídicas abarrotadas y soportadas, junto con varios ensayos de moléculas individuales realizados en ellas y las rutinas de análisis correspondientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, demostramos experimentos de una sola molécula en bicapas lipídicas soportadas (SLB) que manifiestan un ambiente abarrotado para biomoléculas incrustadas en membrana. El ambiente hacinado genera un efecto de volumen excluido, lo que lleva a la mejora de las reacciones biomoleculares 1,2,39,40. Para el sistema PEG-lipídico, donde el polímero ocupa principalmente el volumen fuera de la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen al Prof. Benjamin Schuler por compartir el plásmido de expresión de la proteína ClyA. Este trabajo fue apoyado por Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).
Materials
| 2.5 ml Syringes | HMD Healthcare | Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin | Plastic syringe |
| Acetone | Finar Chemicals | 10020LL025 | |
| Acrylic Sheet | 2 mm thick | ||
| Acrylic Sheet | BigiMall | 2 mm, Clear | |
| Bath Sonicator | Branson | CPX-1800 | |
| Calcium Chloride | |||
| Chloroform | Sigma | 528730 | HPLC grade |
| Cholesterol | Avanti | 700100 | |
| Coplin Jar | Duran Wheaton Kimble | S6016 | 8 Slide Jar with Glass Cover |
| Coverslips | VWR | 631-1574 | 24 mm X 50 mm |
| Cy3-DNA Strand | IDT | GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3 |
|
| Cyanine Dye (Cy3) | Cytiva Life Sciences | PA23001 | |
| DiI | Invitrogen | D3911 | Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) |
| DNA Connector Strand 1 | Sigma Aldrich | GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T |
|
| DNA Connector Strand 2 | Sigma Aldrich | CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT |
|
| DNA Tocopherol Strand | Biomers | Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA | |
| DOPE-PEG2000 | Avanti | 880130 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| Double Sided Tape | 3M | LF93010LE | |
| Drill Bits (Diamond Coated) | 0.5 – 1 mm | ||
| Drilling Machine | Dremel | 220 | Workstation |
| EMCCD | Andor | DU-897U-CS0-#BV | |
| Fluorescence Beads | Invitrogen | F10720 | |
| Glass Slides | Blue Star | Micro Slides, PIC-1 | |
| Glass Vials | Sigma | 854190 | |
| Hydrogen Peroxide | Lobachemie | 00182 | 30% Solution, AR Grade |
| Labolene | Thermo-Fischer Scientific | Detergent | |
| Laser 532 nm | Coherent | Sapphire | |
| Laser Cutter | Universal Laser Systems | ILS12.75 | |
| Lissamine Rhodamine DOPE | Avanti | 810150 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) |
| Methanol | Finar Chemicals | 30932LL025 | |
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | 1X | ||
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma Inc | PDC-002 | |
| POPC | Avanti | 850457 | 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine |
| Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE1010 | High Pressure Syringe Pump |
| PTFE Caps | Sigma | 27141 | |
| PTFE Tubing | Cole-Parmer | WW-06417-21 | Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD |
| Sulphuric Acid | SD Fine Chemicals | 98%, AR Grade | |
| TIRF Objective | Olympus | UPLAPO100XOHR | |
| Vacuum Desiccator | Tarsons | ||
| Vortex Mixer | Tarsons |
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