בדיקת גרביטקסיס בקנה מידה גדול של זחלי Caenorhabditis Dauer
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתווה שיטות לביצוע בדיקת גרביטקסיס בקנה מידה גדול עם זחלי Caenorhabditis dauer. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי טוב יותר של התנהגות גרביטקסיס בהשוואה לבדיקה מבוססת צלחת.
Abstract
תחושת הכבידה היא תהליך חשוב ויחסית לא מובן מאליו. חישת כוח המשיכה מאפשרת לבעלי חיים לנווט בסביבתם ומקלה על התנועה. בנוסף, תחושת הכבידה, המתרחשת באוזן הפנימית של היונקים, קשורה קשר הדוק לשמיעה – ולכן, להבנת תהליך זה יש השלכות על מחקר שמיעתי ושיווי משקל. מבחני גרביטקסיס קיימים עבור כמה אורגניזמי מודל, כולל דרוזופילה. תולעים בודדות נבדקו בעבר על העדפת האוריינטציה שלהן כשהן שוקעות בתמיסה. עם זאת, בדיקה אמינה וחזקה עבור Caenorhabditis gravitaxis לא תואר. הפרוטוקול הנוכחי מתווה הליך לביצוע מבחני גרביטקסיס שניתן להשתמש בהם כדי לבחון מאות דאוארים של Caenorhabditis בכל פעם. בדיקה ארוכת טווח בקנה מידה גדול זו מאפשרת איסוף נתונים מפורט, וחושפת פנוטיפים שעלולים להתפספס בבדיקה סטנדרטית מבוססת צלחת. תנועת דאואר לאורך הציר האנכי מושווית לבקרות אופקיות כדי להבטיח שהטיית הכיוון נובעת מכוח הכבידה. לאחר מכן ניתן להשוות את העדפת הכבידה בין זנים או תנאי ניסוי. שיטה זו יכולה לקבוע דרישות מולקולריות, תאיות וסביבתיות עבור גרביטקסיס בתולעים.
Introduction
חישת כוח המשיכה של כדור הארץ חיונית להתמצאות, לתנועה, לקואורדינציה ולאיזון של אורגניזמים רבים. עם זאת, המנגנונים המולקולריים והנוירו-מעגלים של תחושת הכבידה אינם מובנים היטב בהשוואה לחושים אחרים. אצל בעלי חיים, תחושת הכבידה מתקשרת עם גירויים אחרים ויכולה להיות מוגברת על ידי גירויים אחרים כדי להשפיע על ההתנהגות. ניתן לשלב רמזים חזותיים, משוב פרופריוצפטיבי ומידע שיווי משקל כדי ליצור תחושה של מודעות לגוף ביחס לסביבתו של בעל החיים 1,2. לעומת זאת, ניתן לשנות את העדפת הכבידה בנוכחות גירויים אחרים 3,4,5. לכן, התנהגות כבידתית היא אידיאלית לחקר תחושת הכבידה ולהבנת האינטגרציה החושית המורכבת של מערכת העצבים וקבלת ההחלטות.
C. elegans הוא אורגניזם מודל שימושי במיוחד לחקר גרביטקסיס בגלל מחזור החיים הפוליפני שלו. כאשר הם נחשפים לגורמי עקה במהלך ההתפתחות, כולל חום, צפיפות או מחסור במזון, זחלי C. elegans מתפתחים לדאוארים, שהם עמידים מאוד ללחץ6. בתור דאוארים, תולעים מבצעות התנהגויות אופייניות, כגון ניקוטציה, שבה תולעים “עומדות” על זנבן ומנופפות בראשן, שעשויות להקל על פיזור לבתי גידול טובים יותר7. מבחני גרביטקסיס של C. elegans ו– C. japonica מצביעים על כך שזחלי דאואר הם בעלי כבידה שלילית, וכי התנהגות זו נצפית בקלות רבה יותר אצל דאוארים מאשר אצל מבוגרים 8,9. בדיקת גרביטקסיס בזנים אחרים של Caenorhabditis עשויה לגלות שונות טבעית בהתנהגות הכבידה.
מנגנונים לתחושת הכבידה אופיינו באוגלנה, דרוזופילה, סיונה ומינים שונים אחרים באמצעות מבחני גרביטקסיס 3,10,11. בינתיים, מחקרי גרביטקסיס ב– Caenorhabditis סיפקו בתחילה תוצאות מעורבות. מחקר על העדפת האוריינטציה של C. elegans מצא כי תולעים מכוונות עם ראשן למטה בתמיסה, מה שמרמז על העדפה גרביטקטית חיובית12. בינתיים, למרות ש-C. japonica dauers זוהו בשלב מוקדם כבעלי כבידה שלילית8, התנהגות זו תוארה רק לאחרונה ב-C. elegans9. מספר אתגרים מתעוררים בפיתוח בדיקת גרביטקסיס מייצגת בתולעים. זני Caenorhabditis נשמרים על צלחות אגר; מסיבה זו, מבחנים התנהגותיים משתמשים בדרך כלל בלוחות אגר כחלק מתכנון הניסוישלהם 13,14,15. בדיקת הכבידה המוקדמת ביותר שדווחה ב– Caenorhabditis בוצעה על ידי העמדת צלחת על צדה בזווית של 90° ללוח הבקרה האופקי8. עם זאת, התנהגות גרביטקסיס אינה תמיד חזקה בתנאים אלה. בעוד שניתן לבחון תולעים בוגרות להעדפה אוריינטלית בתמיסה12, העדפה כיוונית זו עשויה להיות גם תלוית הקשר, מה שמוביל להתנהגויות שונות אם התולעים זוחלות במקום לשחות. בנוסף, C. elegans רגישים לגירויים אחרים, כולל אור ושדות אלקטרומגנטיים16,17, אשר מפריעים לתגובותיהם לכוח הכבידה9. לכן, מבחן גרביטקסיס מעודכן המגן מפני משתנים סביבתיים אחרים חשוב לניתוח המנגנונים של תהליך חושי זה.
בפרוטוקול הנוכחי מתוארת בדיקה לתצפית על Caenorhabditis gravitaxis. המערך למחקר זה מבוסס בחלקו על שיטה שפותחה כדי לחקור שלמות נוירומוסקולרית18,19. זחלי דאואר מתורבתים ומבודדים באמצעות נהלים סטנדרטיים20. לאחר מכן הם מוזרקים לתאים העשויים משני פיפטות סרולוגיות של 5 מ”ל מלאות באגר. תאים אלה יכולים להיות מכוונים אנכית או אופקית וממוקמים בתוך כלוב פאראדיי חשוך למשך 12-24 שעות כדי להגן מפני אור ושדות אלקטרומגנטיים. מיקומה של כל תולעת בתאים נרשם ומושווה למוניות האנכיות של זן ייחוס כגון C. elegans N2.
Protocol
Representative Results
Discussion
השוואה עם שיטות קודמות
שלא כמו כימוטקסיס, לא ניתן לצפות באופן מהימן בגרביטקסיס בקאנורהבדיטיס באמצעות תכנון ניסיוני מסורתי של צלחת אגר. קוטרה של צלחת פטרי סטנדרטית הוא 150 מ”מ, וכתוצאה מכך רק 75 מ”מ זמינים בשני הכיוונים עבור דאוארים כדי להדגים את העדפת הגרביטקסיס. למרות שניתן ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקי מחקר של המכונים הלאומיים לבריאות ל- JHR (#R01 5R01HD081266 ו- #R01GM141493). חלק מהזנים סופקו על ידי CGC, הממומן על ידי משרד תוכניות תשתית המחקר של NIH (P40 OD010440). ברצוננו להודות לפראדיפ ג’ושי (UCSB) על תגובת המערכת שלו. ייעוץ סטטיסטי הניתן על ידי UCSB DATALAB.
Materials
| 1% Sodium Dodecyl Sulfate solution | From stock 10% (w/v) SDS in DI water | ||
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 3 mm Hex key | Other similar sized metal tools may be used | ||
| 4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) – 1 L | Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL) | ||
| 5 mL Serological pipettes | Fisherbrand | S68228C | Polystyrene, not borosilicate glass |
| 60% Cold sucrose solution | 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C | ||
| AF16 C. briggsae or other experimental strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| Bunsen burner | |||
| Cling-wrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Clinical centrifuge | |||
| Disposable razor blades | Fisherbrand | 12-640 | |
| Faraday cage | Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger | ||
| Ink markers | Sharpie or other brand for marking on plastic | ||
| Labeling tape | Carolina | 215620 | |
| M9 buffer | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl | ||
| N2 C. elegans strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| NGM plates with OP50 | 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50 | ||
| Paraffin film | Bemis | 13-374-10 | |
| Plastic cutting board | |||
| Pliers | |||
| Rotating vertical mixer | BTLab SYSTEMS | BT913 | With 22 x 15 mL tube bar |
| Serological pipettor | Corning | 357469 | |
| Stereo Microscope | Laxco | S2103LS100 | |
| Tally counter | ULINE | H-7350 | |
| Thick NGM/agar plate media – 1 L | See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar | ||
| Tweezers |
References
- Peterka, R. J. Sensory integration for human balance control. Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).
- Lacquaniti, F., et al. Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates. BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).
- Bostwick, M., et al. Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors. Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).
- Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -. P. High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis. Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).
- Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway. Nature Communications. 5, 4391 (2014).
- Frézal, L., Félix, M. -. A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
- Lee, H., et al. a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons. Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).
- Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae. The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).
- Ackley, C., et al. Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans. bioRxiv. , (2022).
- Häder, D. -. P., Hemmersbach, R., Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. Gravitaxis in Euglena. Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. , 237-266 (2017).
- Sun, Y., et al. TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston’s organ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).
- Chen, W. -. L., Ko, H., Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Bau, H. H. Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis. BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).
- Vidal-Gadea, A., et al. Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans. eLife. 4, 07493 (2015).
- Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals. Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).
- Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).
- Ow, M. C., Hall, S. E. A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae. Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).
- Karp, X. Working with dauer larvae. WormBook. , 1-19 (2018).
- Dinno, A. Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn’s test. The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).
- Gray, J. M., et al. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).
- Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
- Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. C. elegans: a sensible model for sensory biology. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).
- Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).
- Iliff, A. J., et al. The nematode C. elegans senses airborne sound. Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).
- Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans. Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).
- Wicks, S., Rankin, C. Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 15, 2434-2444 (1995).
- Chen, X., Chalfie, M. Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).
- Stockand, J. D., Eaton, B. A. Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron. Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).
- Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear. Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).
- Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. Genetic disorders of the vestibular system. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).
- Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. Genetics of vestibular syndromes. Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).
- Mei, C., et al. Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders. Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).
- Weghorst, F. P., Cramer, K. S. The evolution of hearing and balance. eLife. 8, 44567 (2019).
