Grootschalige Gravitaxis-test van Caenorhabditis Dauer-larven
Summary
Het huidige protocol schetst methoden voor het uitvoeren van een grootschalige gravitaxis-test met Caenorhabditis dauer-larven. Dit protocol zorgt voor een betere detectie van gravitaxis-gedrag in vergelijking met een op platen gebaseerde test.
Abstract
Zwaartekrachtsensatie is een belangrijk en relatief onderbelicht proces. Het waarnemen van de zwaartekracht stelt dieren in staat om door hun omgeving te navigeren en vergemakkelijkt beweging. Bovendien is het zwaartekrachtgevoel, dat optreedt in het binnenoor van het zoogdier, nauw verwant aan het gehoor – dus het begrijpen van dit proces heeft implicaties voor auditief en vestibulair onderzoek. Gravitaxis-assays bestaan voor sommige modelorganismen, waaronder Drosophila. Enkele wormen zijn eerder getest op hun oriëntatievoorkeur terwijl ze zich in oplossing vestigen. Een betrouwbare en robuuste test voor Caenorhabditis gravitaxis is echter niet beschreven. Het huidige protocol schetst een procedure voor het uitvoeren van gravitaxis-assays die kunnen worden gebruikt om honderden Caenorhabditis dauers tegelijk te testen. Deze grootschalige, langeafstandstest maakt gedetailleerde gegevensverzameling mogelijk, waarbij fenotypen worden onthuld die mogelijk worden gemist op een standaard op platen gebaseerde test. Dauer-beweging langs de verticale as wordt vergeleken met horizontale bedieningselementen om ervoor te zorgen dat directionele vertekening te wijten is aan de zwaartekracht. Gravitactische voorkeur kan dan worden vergeleken tussen stammen of experimentele omstandigheden. Deze methode kan moleculaire, cellulaire en omgevingsvereisten voor gravitaxis in wormen bepalen.
Introduction
Het voelen van de zwaartekracht van de aarde is cruciaal voor de oriëntatie, beweging, coördinatie en balans van veel organismen. De moleculaire mechanismen en neurocircuits van zwaartekrachtsensatie zijn echter slecht begrepen in vergelijking met andere zintuigen. Bij dieren werkt het zwaartekrachtgevoel samen met en kan het worden weggeconcurreerd door andere stimuli om gedrag te beïnvloeden. Visuele signalen, proprioceptieve feedback en vestibulaire informatie kunnen worden geïntegreerd om een gevoel van lichaamsbewustzijn te genereren ten opzichte van de omgeving van een dier 1,2. Omgekeerd kan de gravitactische voorkeur worden gewijzigd in aanwezigheid van andere stimuli 3,4,5. Daarom is gravitactisch gedrag ideaal voor het bestuderen van zwaartekrachtsensatie en het begrijpen van de complexe sensorische integratie en besluitvorming van het zenuwstelsel.
C. elegans is een bijzonder nuttig modelorganisme voor het bestuderen van gravitaxis vanwege zijn polyfenische levenscyclus. Bij blootstelling aan stressoren tijdens de ontwikkeling, waaronder hitte, overbevolking of een gebrek aan voedsel, ontwikkelen C. elegans-larven zich tot dauers, die zeer stressbestendig zijn6. Als dauers voeren wormen kenmerkend gedrag uit, zoals nictatie, waarbij wormen op hun staart “staan” en met hun hoofd zwaaien, wat verspreiding naar betere habitats kan vergemakkelijken7. Gravitaxis-assays van C. elegans en C. japonica suggereren dat dauerlarven negatief gravitax zijn, en dat dit gedrag gemakkelijker wordt waargenomen bij dauers dan bij volwassenen 8,9. Het testen van gravitaxis in andere Caenorhabditis-stammen kan natuurlijke variatie in gravitactisch gedrag onthullen.
Mechanismen voor zwaartekrachtsensatie zijn gekarakteriseerd in Euglena, Drosophila, Ciona en verschillende andere soorten met behulp van gravitaxis-assays 3,10,11. Ondertussen leverden gravitaxisstudies in Caenorhabditis aanvankelijk gemengde resultaten op. Een studie van C. elegans oriëntatievoorkeur wees uit dat wormen zich oriënteren met hun hoofd naar beneden in oplossing, wat een positieve gravitactische voorkeur suggereert12. Ondertussen, hoewel C. japonica dauers al vroeg werden geïdentificeerd als negatief gravitactisch8, is dit gedrag pas onlangs beschreven in C. elegans9. Verschillende uitdagingen doen zich voor bij het ontwikkelen van een representatieve gravitaxis-test in wormen. Caenorhabditis stammen worden onderhouden op agar platen; om deze reden gebruiken gedragstests meestal agarplaten als onderdeel van hun experimentele ontwerp 13,14,15. De vroegst gerapporteerde gravitaxistest bij Caenorhabditis werd uitgevoerd door een plaat op zijn kant te laten staan in een hoek van 90° ten opzichte van de horizontale controleplaat8. Gravitaxis-gedrag is echter niet altijd robuust onder deze omstandigheden. Hoewel volwassen wormen in oplossing12 kunnen worden getest op oriëntatievoorkeur, kan deze richtingsvoorkeur ook contextafhankelijk zijn, wat leidt tot ander gedrag als de wormen kruipen in plaats van zwemmen. Bovendien is C. elegans gevoelig voor andere stimuli, waaronder licht en elektromagnetische velden16,17, die interfereren met hun reacties op zwaartekracht9. Daarom is een bijgewerkte gravitaxis-test die beschermt tegen andere omgevingsvariabelen belangrijk voor het ontleden van de mechanismen van dit sensorische proces.
In dit protocol wordt een test voor het observeren van Caenorhabditis gravitaxis beschreven. De opzet voor deze studie is deels gebaseerd op een methode die is ontwikkeld om neuromusculaire integriteit tebestuderen 18,19. Dauerlarven worden gekweekt en geïsoleerd met behulp van standaardprocedures20. Ze worden vervolgens geïnjecteerd in kamers gemaakt van twee serologische pipetten van 5 ml gevuld met agar. Deze kamers kunnen verticaal of horizontaal worden georiënteerd en gedurende 12-24 uur in een donkere kooi van Faraday worden geplaatst om te beschermen tegen licht en elektromagnetische velden. De locatie van elke worm in de kamers wordt geregistreerd en vergeleken met de verticale taxi’s van een referentiestam zoals C. elegans N2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vergelijking met eerdere methoden
In tegenstelling tot chemotaxis kan gravitaxis bij Caenorhabditis niet betrouwbaar worden waargenomen met behulp van een traditioneel experimenteel ontwerp van de agarplaat. Een standaard petrischaal heeft een diameter van 150 mm, wat resulteert in slechts 75 mm beschikbaar in beide richtingen voor dauers om gravitaxis-voorkeur aan te tonen. Hoewel de oriëntatievoorkeur van C. elegans kan worden getest in oplossing12, is deze…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door onderzoekssubsidies van de National Institutes of Health aan JHR (#R01 5R01HD081266 en #R01GM141493). Sommige stammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). We willen Pradeep Joshi (UCSB) bedanken voor zijn redactionele inbreng. Statistische raadpleging door het UCSB DATALAB.
Materials
| 1% Sodium Dodecyl Sulfate solution | From stock 10% (w/v) SDS in DI water | ||
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 3 mm Hex key | Other similar sized metal tools may be used | ||
| 4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) – 1 L | Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL) | ||
| 5 mL Serological pipettes | Fisherbrand | S68228C | Polystyrene, not borosilicate glass |
| 60% Cold sucrose solution | 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C | ||
| AF16 C. briggsae or other experimental strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| Bunsen burner | |||
| Cling-wrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Clinical centrifuge | |||
| Disposable razor blades | Fisherbrand | 12-640 | |
| Faraday cage | Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger | ||
| Ink markers | Sharpie or other brand for marking on plastic | ||
| Labeling tape | Carolina | 215620 | |
| M9 buffer | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl | ||
| N2 C. elegans strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| NGM plates with OP50 | 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50 | ||
| Paraffin film | Bemis | 13-374-10 | |
| Plastic cutting board | |||
| Pliers | |||
| Rotating vertical mixer | BTLab SYSTEMS | BT913 | With 22 x 15 mL tube bar |
| Serological pipettor | Corning | 357469 | |
| Stereo Microscope | Laxco | S2103LS100 | |
| Tally counter | ULINE | H-7350 | |
| Thick NGM/agar plate media – 1 L | See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar | ||
| Tweezers |
References
- Peterka, R. J. Sensory integration for human balance control. Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).
- Lacquaniti, F., et al. Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates. BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).
- Bostwick, M., et al. Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors. Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).
- Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -. P. High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis. Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).
- Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway. Nature Communications. 5, 4391 (2014).
- Frézal, L., Félix, M. -. A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
- Lee, H., et al. a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons. Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).
- Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae. The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).
- Ackley, C., et al. Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans. bioRxiv. , (2022).
- Häder, D. -. P., Hemmersbach, R., Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. Gravitaxis in Euglena. Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. , 237-266 (2017).
- Sun, Y., et al. TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston’s organ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).
- Chen, W. -. L., Ko, H., Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Bau, H. H. Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis. BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).
- Vidal-Gadea, A., et al. Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans. eLife. 4, 07493 (2015).
- Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals. Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).
- Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).
- Ow, M. C., Hall, S. E. A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae. Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).
- Karp, X. Working with dauer larvae. WormBook. , 1-19 (2018).
- Dinno, A. Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn’s test. The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).
- Gray, J. M., et al. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).
- Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
- Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. C. elegans: a sensible model for sensory biology. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).
- Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).
- Iliff, A. J., et al. The nematode C. elegans senses airborne sound. Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).
- Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans. Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).
- Wicks, S., Rankin, C. Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 15, 2434-2444 (1995).
- Chen, X., Chalfie, M. Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).
- Stockand, J. D., Eaton, B. A. Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron. Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).
- Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear. Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).
- Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. Genetic disorders of the vestibular system. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).
- Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. Genetics of vestibular syndromes. Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).
- Mei, C., et al. Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders. Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).
- Weghorst, F. P., Cramer, K. S. The evolution of hearing and balance. eLife. 8, 44567 (2019).
