מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות להפעלה מחדש של קולטנים סינפטיים אנושיים למחקרים פונקציונליים
Summary
הפרוטוקול מדגים כי על ידי ביצוע מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות לתוך ביציות קסנופוס לאוויס , ניתן לרשום תגובות עקביות ואמינות של α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-איזוקסזולפרופיונית וחומצה γ-אמינו-בוטירית.
Abstract
קולטנים יונוטרופיים מעוררים ומעכבים הם השערים העיקריים של שטפי יונים הקובעים את פעילות הסינפסות במהלך תקשורת עצבית פיזיולוגית. לכן, שינויים בשפע, בתפקודם ובקשריהם עם אלמנטים סינפטיים אחרים נצפו כמתאם עיקרי של שינויים בתפקוד המוח ופגיעה קוגניטיבית במחלות נוירודגנרטיביות והפרעות נפשיות. הבנת האופן שבו הפונקציה של קולטנים סינפטיים מעוררים ומעכבים משתנה על ידי מחלה היא בעלת חשיבות קריטית לפיתוח טיפולים יעילים. כדי לקבל מידע רלוונטי למחלה, חשוב לתעד את הפעילות החשמלית של קולטני נוירוטרנסמיטר שנותרים מתפקדים במוח האנושי החולה. עד כה זוהי הגישה הקרובה ביותר להערכת שינויים פתולוגיים בתפקוד הקולטנים. בעבודה זו מוצגת מתודולוגיה לביצוע מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות, המורכבת מהפעלה מחדש של ממברנות סינפטיות מרקמת מוח אנושית קפואה המכילה קולטנים אנושיים, על ידי הזרקתה ואיחוי אחורי לתוך הממברנה של ביציות Xenopus laevis . הפרוטוקול מספק גם את האסטרטגיה המתודולוגית להשגת תגובות עקביות ואמינות של α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-איזוקסזולפרופיונית (AMPA) וקולטני חומצה γ-אמינו-בוטירית (GABA), כמו גם שיטות מפורטות חדשניות המשמשות לנורמליזציה ולניתוח נתונים קפדני.
Introduction
הפרעות נוירודגנרטיביות משפיעות על אחוז גדול מהאוכלוסייה. למרות שתוצאותיהם ההרסניות ידועות היטב, הקשר בין השינויים התפקודיים של קולטני נוירוטרנסמיטר, שהם קריטיים לתפקוד המוח, והסימפטומטולוגיה שלהם עדיין לא מובן היטב. שונות בין-אישית, האופי הכרוני של המחלה והתפרצות חתרנית של תסמינים הם רק חלק מהסיבות שעיכבו את ההבנה של הפרעות המוח הרבות שבהן חוסר האיזון הכימי מתועד היטב 1,2. מודלים של בעלי חיים יצרו מידע שלא יסולא בפז והרחיבו את הידע שלנו על המנגנונים העומדים בבסיס הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה במערכות משומרות אבולוציוניות; עם זאת, מספר הבדלים בין-מיניים בין מכרסמים לבני אדם מונעים אקסטרפולציה ישירה של תפקוד הקולטנים ממודלים של בעלי חיים למוח האנושי3. לפיכך, המאמצים הראשוניים לחקור קולטנים אנושיים מקומיים פותחו על ידי מעבדתו של ריקרדו מילדי באמצעות רקמות שהוסרו בניתוח ודגימות קפואות. ניסויים ראשוניים אלה השתמשו בממברנות שלמות הכוללות קולטנים סינפטיים עצביים וסינפטיים נוספים, כמו גם קולטני נוירוטרנסמיטר שאינם עצביים, ולמרות שהם מספקים מידע חשוב על מצבים חולים, קיים חשש שתמהיל הקולטנים מסבך את הפרשנות של נתונים 4,5,6,7. חשוב לציין, סינפסות הן המטרה העיקרית בהפרעות נוירודגנרטיביות רבות 8,9; לכן, מבחנים לבדיקת התכונות התפקודיות של סינפסות מושפעות הם בסיסיים כדי לקבל מידע על שינויים רלוונטיים למחלה המשפיעים על התקשורת הסינפטית. כאן מתואר שינוי של השיטה המקורית: מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות (MSM), המתמקדת באפיון פיזיולוגי של תכשירי חלבונים סינפטיים מועשרים ויושמה בהצלחה בחקר חולדות וסינפטוסומים אנושיים 10,11,12,13,14,15 . בעזרת מתודולוגיה זו, ניתן להשתיל קולטנים סינפטיים שפעם עבדו במוח האנושי, משובצים בשומנים המקומיים שלהם ועם קבוצת חלבונים נלווים משלהם. יתר על כן, מכיוון שנתוני MSM הם כמותיים, ניתן להשתמש בנתונים אלה כדי להשתלב עם מערכי נתונים פרוטאומיים או רצף גדולים10.
חשוב לציין כי ניתוחים פרמקולוגיים וביופיזיים רבים של קולטנים סינפטיים נעשים על חלבונים רקומביננטיים16,17. בעוד שגישה זו מספקת תובנה טובה יותר לגבי יחסי מבנה-תפקוד של קולטנים, היא אינה יכולה לספק מידע על קומפלקסים מורכבים של קולטנים רב-מתכתיים המצויים בתאי עצב ועל השינויים שלהם במחלות. לכן, שילוב של חלבונים מקומיים ורקומביננטיים צריך לספק ניתוח מקיף יותר של קולטנים סינפטיים.
ישנן שיטות רבות להכנת סינפטוזומים 10,11,12,13,14,15 אשר ניתן להתאים לדרישות המעבדה. הפרוטוקול מתחיל בהנחה שתכשירים מועשרים סינפטוזומליים בודדו ומוכנים לעיבוד לניסויים במיקרו-טרנספלנטציה. במעבדה, נעשה שימוש בשיטת Syn-Per בהתאם להוראות היצרן. זה נעשה בגלל יכולת שכפול גבוהה בניסויים אלקטרופיזיולוגיים10,11. יש גם ספרות בשפע המסביר כיצד לבודד את ביציות קסנופוס 18,19, אשר ניתן לרכוש גם מוכן להזרקה20.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח של קומפלקסים חלבוניים מקומיים ממוחות אנושיים נחוץ כדי להבין תהליכים הומאוסטטיים ופתולוגיים בהפרעות מוחיות ולפתח אסטרטגיות טיפוליות למניעה או לטיפול במחלות. לפיכך, בנקי מוח המכילים דגימות קפואות הצמדה הם מקור שלא יסולא בפז לעושר גדול ובעיקר לא מנוצל של מידע פיזיולוגי29,30</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIA/NIH R01AG070255 ו-R01AG073133 ל-AL. אנו מודים גם למרכז לחקר מחלת האלצהיימר של אוניברסיטת קליפורניה אירווין (UCI-ADRC) על שסיפק את הרקמה האנושית המוצגת בכתב יד זה. UCI-ADRC ממומן על ידי מענק NIH / NIA P30 AG066519.
Materials
| For Microinjection | |||
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| 24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
| Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
| Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
| Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
| Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
| Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
| Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
| For Two Electrode Voltage clamp | |||
| 15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
| Any PC computer or laptop | |||
| Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
| ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
| WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
| X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
| Reagents | |||
| Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
| Kainic acid | Tocris | 0222 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
| Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
| Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
| Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |
References
- Furcila, D., Defelipe, J., Alonso-Nanclares, L. A study of amyloid-β and phosphotau in plaques and neurons in the hippocampus of Alzheimer’s disease patients. Journal of Alzheimer’s Disease. 64 (2), 417-435 (2018).
- Varol, E., Sotiras, A., Davatzikos, C. HYDRA: revealing Heterogeneity of imaging and genetic patterns through a multiple max-margin discriminative analysis framework. Neuroimaje. 145, 346-364 (2017).
- Hodge, R. v. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Wu, J., et al. GABAA receptor-mediated excitation in dissociated neurons from human hypothalamic hamartomas. Experimental Neurology. 213 (2), 397-404 (2008).
- Miledi, R., Eusebi, F., Martínez-Torres, A., Palma, E., Trettel, F. Expression of functional neurotransmitter receptors in Xenopus oocytes after injection of human brain membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 13238-13242 (2002).
- Zwart, R., Mazzo, F., Sher, E. Microtransplantation of human brain receptors into oocytes to tackle key questions in drug discovery. Drug Discovery Today. 24 (2), 533-543 (2019).
- Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Miledi, R. Microtransplantation of neurotransmitter receptors from postmortem autistic brains to Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10973-10977 (2008).
- Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
- Taoufik, E., Kouroupi, G., Zygogianni, O., Matsas, R. Synaptic dysfunction in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases: An overview of induced pluripotent stem-cell-based disease models. Open Biology. 8 (9), 180138 (2018).
- Zeppillo, T., et al. Functional impairment of cortical AMPA receptors in schizophrenia. Schizophrenia Research. , (2020).
- Lauterborn, J. C., et al. Increased excitatory to inhibitory synaptic ratio in parietal cortex samples from individuals with Alzheimer’s disease. Nature Communications. 12 (1), 2603 (2021).
- Mazzo, F., et al. Reconstitution of synaptic Ion channels from rodent and human brain in Xenopus oocytes: a biochemical and electrophysiological characterization. Journal of Neurochemistry. 138 (3), 384-396 (2016).
- Sanna, E., et al. Expression of native GABA(A) receptors in Xenopus oocytes injected with rat brain synaptosomes. Journal of Neurochemistry. 67 (5), 2212-2214 (1996).
- Sanna, E., et al. Functional changes in rat nigral GABA(A) receptors induced by degeneration of the striatonigral GABAergic pathway: An electrophysiological study of receptors incorporated into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 70 (6), 2539-2544 (1998).
- Sandoval, M., et al. Antagonistic effects of TrkB and p75NTR on NMDA receptor currents in post-synaptic densities transplanted into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 101 (6), 1672-1684 (2007).
- Perrais, D., Pinheiro, P. S., Jane, D. E., Mulle, C. Antagonism of recombinant and native GluK3-containing kainate receptors. Neuropharmacology. 56 (1), 131-140 (2009).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364 (6438), 355-362 (2019).
- Bröer, S. Xenopus laevis Oocytes. Membrane Transporters in Drug Discovery and Development: Methods and Protocols. , 295-310 (2010).
- Newman, K., Aguero, T., King, M. Lou Isolation of xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (2), 86-91 (2018).
- Lin-Moshier, Y., Marchant, J. S. The Xenopus oocyte: A single-cell model for studying Ca2+ signaling. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (3), 185-191 (2013).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Microinjection of Xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Eusebi, F., Palma, E., Amici, M., Miledi, R. Microtransplantation of ligand-gated receptor-channels from fresh or frozen nervous tissue into Xenopus oocytes: A potent tool for expanding functional information. Progress in Neurobiology. 88 (1), 32-40 (2009).
- Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 5224-5228 (1995).
- Cutting, G. R., et al. Cloning of the γ-aminobutyric acid (GABA) ρ1 cDNA: A GABA receptor subunit highly expressed in the retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (7), 2673-2677 (1991).
- Calvo, D. J., Vazquez, A. E., Miledi, R. Cationic modulation of ρ1-type γ-aminobutyrate receptors expressed in Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 12725-12729 (1994).
- Martínez-Torres, A., Miledi, R. Expression of γ-aminobutyric acid ρ1 and ρ1Δ450 as gene fusions with the green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 1947-1951 (2001).
- Ochoa-De La Paz, L. D., Estrada-Mondragón, A., Limón, A., Miledi, R., Martínez-Torres, A. Dopamine and serotonin modulate human GABAρ1 receptors expressed in Xenopus laevis oocytes. ACS Chemical Neuroscience. 3 (2), 96-104 (2012).
- Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Eusebi, F., Miledi, R. Properties of GluR3 receptors tagged with GFP at the amino or carboxyl terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (39), 15526-15530 (2007).
- C, S. N. A Rosetta stone for analysis of human membrane protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10641-10642 (2008).
- Eleonora, P., et al. GABAA-current rundown of temporal lobe epilepsy is associated with repetitive activation of GABAA "phasic" receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (52), 20944-20948 (2007).
- Bond, B. C., et al. The quantification of gene expression in an animal model of brain ischaemia using TaqManTM real-time RT-PCR. Molecular Brain Research. 106 (1-2), 101-116 (2002).
- Preece, P., Cairns, N. J. Quantifying mRNA in postmortem human brain: influence of gender, age at death, postmortem interval, brain pH, agonal state and inter-lobe mRNA variance. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 60-71 (2003).
- Preece, P., et al. An optimistic view for quantifying mRNA in post-mortem human brain. Molecular Brain Research. 116 (1-2), 7-16 (2003).
- Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: What quality markers matter. Brain Research. 1123 (1), 1-11 (2006).
- Scaduto, P., Sequeira, A., Vawter, M. P., Bunney, W., Limon, A. Preservation of global synaptic excitatory to inhibitory ratio during long postmortem intervals. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
- Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (11), 5224-5228 (1995).
- Le Mauff, A., et al. Nicotinic acetylcholine receptors in the synganglion of the tick Ixodes ricinus: Functional characterization using membrane microtransplantation. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 14, 144-151 (2020).
- Crespin, L., Legros, C., List, O., Tricoire-Leignel, H., Mattei, C. Injection of insect membrane in Xenopus oocyte: An original method for the pharmacological characterization of neonicotinoid insecticides. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 77, 10-16 (2016).
- Soualah, Z., et al. GABAA Receptor Subunit Composition Drives Its Sensitivity to the Insecticide Fipronil. Frontiers in Neuroscience. 15, 1-13 (2021).
- Symington, S. B., Murenzi, E., Toltin, A. C., Lansky, D., Clark, J. M. Realizing the potential: improving a microtransplantation assay based on neurolemma-injected Xenopus oocytes: an ex vivo approach to study ion channels in their native state. ACS Symposium Series. 1264, 53-73 (2017).
- Palma, E., et al. Microtransplantation of membranes from cultured cells to Xenopus oocytes: A method to study neurotransmitter receptors embedded in native lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2896-2900 (2003).
