Microtransplantação de Membranas Sinápticas para Reativar Receptores Sínpticos Humanos para Estudos Funcionais

Distúrbios neurodegenerativos afetam grande parte da população. Embora suas consequências devastadoras sejam bem conhecidas, a ligação entre as alterações funcionais dos receptores neurotransmissores, que são críticas para a função cerebral, e sua sintomatologia ainda é mal compreendida. A variabilidade inter-individual, a natureza crônica da doença e o início insidioso dos sintomas são apenas algumas das razões que atrasaram a compreensão das muitas doenças cerebrais onde os desequilíbrios químicos estão bem documentados ^1,2. Modelos animais geraram informações inestimáveis e expandiram nosso conhecimento sobre os mecanismos subjacentes à fisiologia e à fisiopatologia em sistemas conservados evolutivos; no entanto, várias diferenças entre roedores e humanos impedem a extrapolação direta da função receptora de modelos animais para o cérebro humano³. Assim, os esforços iniciais para estudar receptores humanos nativos foram desenvolvidos pelo laboratório de Ricardo Miledi utilizando tecido removido cirurgicamente e amostras congeladas. Esses experimentos iniciais utilizaram membranas inteiras que incluem receptores sinápticos neuronais e extra-sinápticos, bem como receptores neurotransmissores não neuronais, e embora forneçam informações importantes sobre estados doentes, há uma preocupação de que a mistura de receptores complica a interpretação dos dados 4,5,6,7. É importante ressaltar que as sinapses são o principal alvo em muitas doenças neurodegenerativas ^8,9; portanto, ensaios para testar as propriedades funcionais das sinapses afetadas são fundamentais para obter informações sobre mudanças relevantes para a doença que afetam a comunicação sináptica. Aqui, descreve-se uma modificação do método original: microtransplantação de membranas sinápticas (MSM), que se concentra na caracterização fisiológica de preparações de proteína sináptica enriquecida e foi aplicada com sucesso para estudar sinapttos de ratos e humanos 10,11,12,13,14,15 . Com essa metodologia, é possível transplantar receptores sinápticos que antes trabalhavam no cérebro humano, embutidos em seus próprios lipídios nativos e com sua própria coorte de proteínas associadas. Além disso, como os dados do MSM são quantitativos, é possível usar esses dados para se integrar com grandes conjuntos de dados proteômicos ou sequenciamento¹⁰.

É importante notar que muitas análises farmacológicas e biofísicas de receptores sinápticos são feitas em proteínas recombinantes^16,17. Embora essa abordagem forneça uma melhor visão das relações estrutura-função dos receptores, não pode fornecer informações sobre complexos receptores multimédicos encontrados nos neurônios e suas mudanças na doença. Portanto, uma combinação de proteínas nativas e recombinantes deve fornecer uma análise mais abrangente dos receptores sinápticos.

Existem muitos métodos para preparar sinapstos 10,11,12,13,14,15 que podem ser ajustados para os requisitos de um laboratório. O protocolo começa com a suposição de que as preparações enriquecidas sinaptosômicas foram isoladas e estão prontas para serem processadas para experimentos de microtransplante. No laboratório, o método Syn-Per é usado seguindo as instruções do fabricante. Isso é feito por causa da alta reprodutibilidade em experimentos eletrofisiológicos^10,11. Há também literatura abundante explicando como isolar xenopus oócitos^18,19, que também podem ser comprados prontos para injeção²⁰.