Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

Protein-DNA etkileşimlerini tek molekül düzeyinde ve gerçek zamanlı olarak görselleştirme yeteneği, genom stabilitesi hakkında önemli bilgiler sağlamıştır ^1,2. DNA’nın tek molekülleriyle birer birer çalışmaya ek olarak, yakındaki tek tek moleküller arasındaki işlemleri görüntüleme yeteneği ek içgörü sağlar ^3,4,5. Ek DNA moleküllerinin manipülasyonu hem ek optik tuzaklar hem de yüksek kaliteli, çok kanallı, mikroakışkan akış hücreleri gerektirir⁶.

Birden fazla optik tuzak oluşturmak için kullanılabilecek birkaç yöntem vardır. Bunlar arasında galvanometre tarama aynaları, akustik optik modülatörler ve holografik optik cımbız 4,7,8,9 üreten kırınımsal optikler bulunur. Çoğu zaman, tarama aynaları ve akustik optik modülatörler devre mülk tuzakları üretir. Burada açıklanan kurulumda, tek bir Nd: YAG lazerin ışını polarizasyon üzerine bölünür ve daha sonra galvanometre lazer tarama aynaları mobil tuzak olarak adlandırılan şeyin konumunu kontrol eder (Şekil 1)⁴. Tuzak ışını mikroskop hedefinin arka açıklığına yönlendirmek için aynaların ve filtrelerin konumlandırılmasını kolaylaştırmak için bir HeNe lazer kullanılır. Bu, HeNe ışını çıplak gözle görülebildiği için genel hizalamayı kolaylaştırırken, kızılötesi ışınlar görünmez. HeNe ışını, aynaların ve diğer bileşenlerin konumlandırılmasını daha az stresli hale getirmek için çalışmak için daha güvenlidir. Başlangıçta, bu lazerin ışın yolu 1064 nm ışından ayrıdır, ancak aynı ışın yoluna ve daha sonra mikroskop hedefine sokulur. Fiziksel hizalama sağlandıktan sonra, 1064 nm ışının HeNe ışınının üzerine konumlandırılması yapılır ve bu, ışın konumunu ve kalitesini görselleştirmek için bir kızılötesi görüntüleyici ve çeşitli ışın görüntüleme araçlarının kullanılmasıyla kolaylaştırılır. Daha sonra, ışın genişletici tanıtılır ve elde edilen genişletilmiş kızılötesi ışın, hedefin arka açıklığına hizalanır. Son olarak, hedef kaldırılır ve her polarize ışındaki güç ölçülür ve λ/2 dalga plakaları kullanılarak eşit olacak şekilde ayarlanır (Şekil 1C). Güç ölçümleri, hedefe geri dönüldüğünde de yapılır ve tipik olarak% 53’lük bir güç kaybı olur. Bununla birlikte, odak düzleminde kararlı sabit ve hareketli optik tuzaklar oluşturmak için yeterli güç vardır (Şekil 1D).

DNA işlemlerini görüntülemek için, mikroakışkan akış hücreleri, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip tek molekül düzeyinde kontrollü ölçümlere izin verdikleri için önemli bir rol oynamaktadır (Şekil 2). Mikroakışkan terimi, 5-500 μm^10,11 arasında değişen boyutlarda bir veya daha fazla kanaldaki sıvıları manipüle etme yeteneğini ifade eder. Akış terimi, bir kanal içindeki gerçek sıvıyı ifade eder ve kanal, bir akışkan akışının veya akışlarının hareket ettiği fiziksel kanalı ifade eder. Tek kanallı akış hücresi tasarımı, reaksiyonların gözlemlendiği ve tipik olarak sadece bir sıvı akışının mevcut olduğu ortak, fiziksel bir kanala sahiptir. Bu nedenle, bu tasarımlar tek akışlı akış hücreleri olarak bilinir. Buna karşılık, çok akışlı akış hücreleri, iki veya daha fazla giriş kanalının tek, ortak, fiziksel bir kanalda birleştiği mikroakışkan bir cihaz olarak tanımlanır (Şekil 2A). Ortak kanal içinde, bireysel kanallardan kaynaklanan sıvı akışları birbirine paralel olarak akar ve difüzyon nedeniyle aralarında sadece minimum karışım meydana gelerek ayrı kalır (Şekil 2B). Deney kurulumlarının çoğunda, tek bir pompa sıvıları her kanala aynı hızda iter. Buna karşılık, sınır yönlendirmesi kullanıldığında, üç veya daha fazla, bağımsız olarak kontrol edilen pompa, sıvıları kanallardan iter. Bununla birlikte, her pompa farklı bir hızda çalışır, ancak ortak kanaldaki net akış hızı sabit^12’dir. Bu, sadece pompa hızını değiştirerek ana kanal bileşenlerinin hızlı bir şekilde değiştirilmesini sağlar.

Laminer akışa ek olarak, bir diğer kritik faktör, laminer sıvı akışı içindeki parabolik hız profilidir. En yüksek akış hızı derenin ortasında, en yavaş ise yüzeylerin yanında meydana gelir (Şekil 2C)¹³. Bu profilin, floresan DNA’nın hassas bir şekilde görselleştirilmesi ve doğru tek moleküllü analizler için akışta tutulan bir boncuğa bağlı bir DNA molekülünü tamamen gerdiği düşünülmelidir. Burada, DNA B formuna gerilir ve 0 pN kuvvet altında yerinde tutulur. Bunu başarmak için, optik tuzak konumunun odaklanması alt kapak kayma yüzeyinden 10-20 μm yükseklikte olmalıdır (Şekil 2D). DNA molekülünün B formunun ötesine gerilmemesine dikkat edilmelidir, çünkü bu enzim reaksiyonlarını inhibe edebilir. Tipik tampon koşullar altında, 1 μm = 3.000 bp DNA¹⁴. Ayrıca, kapak kaymasından 10-20 μm uzakta tutularak, DNA kompleksi yüzeyden uzağa yerleştirilir ve böylece yüzey etkileşimleri en aza indirilir.

Mikroakışkan cihaz kanalları oluşturmak için birçok yöntem kullanılmıştır ve bunlar laboratuvarda yapılabilir veya akış hücreleri ticari kaynaklardan satın alınabilir 6,15,16,17. Akış hücrelerini oluşturmak için kullanılan en uygun malzemeler mekanik olarak sert, düşük floresanlı optik olarak şeffaf ve organik çözücülere karşı geçirimsiz olmalıdır⁶. Sıklıkla, borosilikat float cam veya kaynaşmış silika, optik yakalama, görselleştirme ve kuvvet algılama için uygun olan uzun bir süre boyunca istikrarlı bir akış ortamı sağlamak için kullanılır. Bu malzemeler ayrıca yüzey ıslatmasını ve hava kabarcıklarının giderilmesini basitleştirmek için susuz çözücülerin (örneğin, spektrofotometrik sınıf metanol) ve akış hücresini temizlemek için denatürantların (örneğin, 6M guanidinyum hidroklorür) veya deterjanların kullanılmasına izin verir. Son olarak, akışkanları akış hücrelerine sokmak için kullanılan yöntemler, karmaşık vakum pompası sistemlerinden tek şırıngalı pompalara kadar değişir 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Burada açıklanan yaklaşımda, 10 şırıngaya kadar barındırabilen bir şırınga pompası kullanılmıştır (Şekil 3A). Bu, tek kanallı akış hücrelerini veya birden çok giriş kanalına sahip akış hücrelerini kullanma esnekliği sağlar. Burada, üç kanallı bir akış hücresi kullanılır ve poli-eter-eter-keton (PEEK) borusu kullanılarak şırınga pompasında yerinde tutulan şırıngalarla eşleştirilir (Şekil 3A-C). Akışkanların akışı dört yönlü anahtarlama valfleri tarafından kontrol edilir ve böylece kabarcıkların akış hücresine girmesini en aza indirmeye yarar (Şekil 3A, D). Ek olarak, sert cam duvarlara ve politetrafloroetilen (PTFE) kaplı pistonlara sahip Hamilton gaz geçirmez şırıngalar,^pürüzsüz bir akış elde etmek için gerekli olan olağanüstü pürüzsüz piston hareketi sağladıkları için tavsiye edilirler ^14,27.

Açıklanan deneysel sistemde, iki ila beş giriş kanalına sahip akış hücreleri kullanılmıştır. Giriş kanallarının sayısı, yapılan deney tarafından belirlenir. RecBCD ve Hop2-Mnd1 çalışmaları için iki akış kanalı yeterli^14,28 idi. Helikaz için, enzim DNA’nın serbest ucuna bağlandı ve translokasyon ve çözülmeyi başlatmak için magnezyum ve ATP içeren bir akışa çevrildi. Hop2-Mnd1 için, optik olarak hapsedilmiş DNA, proteinler ve tampon ± iki değerli metal iyonları içeren bitişik sıvı akışına çevrildi. Üç kanallı akış hücrelerinin kullanımı, DNA’nın akış 1’de yakalanmasını, protein bağlanmasının gerçekleşmesine izin vermek için DNA’yı akış 2’ye çevirmesini ve daha sonra ATP’nin mevcut olduğu 3. akışa, örneğin reaksiyonları başlatmasını sağlar. Yukarıdakilerin bir varyasyonu, kanal 2’de floresan etiketli protein kullanmaktır, bu da sıvı akışının tamamen beyaz olmasına neden olur ve DNA’nın görselleştirilmesini engeller. Bu molekül akış 3’e çevrildiğinde, reaksiyonlar başlatıldığında hem proteinler hem de DNA artık görülebilir.

Sıvı akışını kontrol etmek için dört yönlü anahtarlama valflerinin kullanılması, akış hücrelerindeki kabarcıkları ortadan kaldırmak için sistemin kritik bir bileşenidir. Kabarcıklar, öngörülemeyen şekillerde büzüldükleri ve genişledikleri için kararlı sıvı akışına zararlıdır, bu da akış hızında hızlı değişikliklere ve türbülansın ortaya çıkmasına neden olur. Vanalar şırıngalar ve giriş boruları arasına yerleştirildiğinde, şırıngalar değiştirildiğinde valf konumu değiştirilerek akış yolunun bağlantısı kesilir. Yeni şırınga yerleştirildiğinde, piston manuel olarak bastırılabilir, böylece >6 μL dışarı atılır (valfin ölü hacmi) ve bu da kabarcıkları neredeyse tamamen ortadan kaldırır.

Bağlayıcıların akış hücrelerine bağlanması, akış hücresi kullanımında genellikle hız sınırlayıcı adımdır. İki tip konektörün kullanımını tanımlıyoruz: prese sığdırma ve kalıcı olanlar (nanoport montajları) olarak bilinen çıkarılabilir. Çıkarılabilir konektörlerin bir akış hücresine yapıştırılması kolaydır ve önerilen PTFE’ye ek olarak farklı esnek boru tipleri bu konektörlerle test edilebilir. Bu, daha pahalı cam akış hücrelerinden ödün vermeden boru ve konektörleri test etmenin hızlı ve uygun maliyetli bir yoludur. Buna karşılık, nanoport tertibatları kalıcı olarak bağlanır, 1.000 psi’ye kadar basınçlara dayanır ve elimizde kullanımları farklı çaplardaki PEEK boruları ile sınırlıdır. PEEK boruları tercihen kullanıldığından bu bir dezavantaj değildir. Kalıcı montajlara sahip tek bir cam akış hücresi, dikkatli kullanımla 1 yıldan fazla bir süre boyunca tekrar kullanılabilir.